Some aspects of the present disclosure provide strategies, methods, and reagents for determining nuclease target site preference and specificity of site-specific endonucleases. Some methods provided herein identify candidate library members that have been cleaved by a nuclease of interest by sequencing an intact target site adjacent to and identical to the cleaved target site. A novel “single cut” strategy is used to screen a library of concatamers containing repeat units of nuclease target sites and constant insertion regions. Some aspects of the present disclosure provide strategies, methods, and reagents for selecting a site-specific endonuclease based on determining its target site preference and specificity. Methods and reagents for determining target site preference and specificity are also provided.本開示のいくつかの側面は、部位特異的エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼターゲット部位選好性および特異性を決定するための戦略、方法、および試薬を提供する。本明細書において提供されるいくつかの方法は、切断されたターゲット部位と隣接しかつ同一の無傷のターゲット部位のシーケンシングによって、目的のヌクレアーゼによって切断されたライブラリーメンバーを同定するために、候補ヌクレアーゼターゲット部位と定常挿入領域とのリピート単位を含むコンカテマーのライブラリーをスクリーニングするための新規の「１回の切断」戦略を利用する。本開示のいくつかの側面は、そのターゲット部位選好性および特異性を決定することに基づく部位特異的エンドヌクレアーゼを選択するための戦略、方法、および試薬を提供する。ターゲット部位選好性および特異性を決定するための方法および試薬もまた提供される。
