Engineered nucleases (e.g., zinc finger nucleases (ZFNs), transcriptional activator-like effector nucleases (TALENs), and others) are promising tools for genome manipulation and determining off-target cleavage sites of these enzymes is of great interest. We developed anin vitroselection method that interrogates 10<；sup>；11<；/sup>；DNA sequences for their ability to be cleaved by active, dimeric nulceases, e.g., ZFNs and TALENs. The method revealed hundreds of thousands of DNA sequences, some present in the human genome, that can be cleavedin vitroby two ZFNs, CCR5-224 and VF2468, which target the endogenous humanCCR5andVEGF-Agenes, respectively. Analysis of the identified sites in cultured human cells revealed CCR5-224-induced mutagenesis at nine off-target loci. Similarly, we observed 31 off-target sites cleaved by VF2468 in cultured human cells. Our findings establish an energy compensation model of ZFN specificity in which excess binding energy contributes to off-target ZFN cleavage and suggest strategies for the improvement of future nuclease design. It was also pobserved that TALENs can achieve cleavage specificity similar to or higher than that observed in ZFNs.操作されたヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等）は、ゲノム操作のための有望なツールであり、これらの酵素のオフターゲット切断部位の決定は大きな関心事である。本発明者らは、活性な二量体ヌクレアーゼ、例えば、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮにより切断され得る否かを、１０１１ＤＮＡ配列について調べるｉｎ ｖｉｔｒｏ選択法を開発した。本方法は、内在性ヒトＣＣＲ５およびＶＥＧＦ－Ａ遺伝子をそれぞれ標的とする、２つのＺＦＮであるＣＣＲ５－２２４およびＶＦ２４６８によりｉｎ ｖｉｔｒｏで切断され得る、一部はヒトゲノム中に存在する、数十万のＤＮＡ配列を明らかにした。培養ヒト細胞中に同定された部位の分析により、９つのオフターゲット遺伝子座でＣＣＲ５－２２４誘導の突然変異誘発が明らかになった。同様に、本発明者らは、培養ヒト細胞においてＶＦ２４６８による３１のオフターゲット部位の切断を観察した。本発明者らの発見は、過剰な結合エネルギーがオフターゲットＺＦＮ切断に寄与する、ＺＦＮ特異性のエネルギー補償モデルを確立し、将来のヌクレアーゼ設計の改善のための戦略を示唆する。さらに、ＴＡＬＥＮが、ＺＦＮにおいて観察されたものと同様かまたはそれより高い切断特異性を達成することができることが観察された。
