Engineered nucleases (e.g., zinc finger nucleases (ZFNs), transcriptional activator-like effector nucleases (TALENs), and others) are promising tools for genome manipulation and determining off-target cleavage sites of these enzymes is of great interest. We developed an in vitro selection method that interrogates 1011 DNA sequences for their ability to be cleaved by active, dimeric nulceases, e.g., ZFNs and TALENs. The method revealed hundreds of thousands of DNA sequences, some present in the human genome, that can be cleaved in vitro by two ZFNs, CCR5-224 and VF2468, which target the endogenous human CCR5 and VEGF-A genes, respectively. Analysis of the identified sites in cultured human cells revealed CCR5-224-induced mutagenesis at nine off-target loci. Similarly, we observed 31 off-target sites cleaved by VF2468 in cultured human cells. Our findings establish an energy compensation model of ZFN specificity in which excess binding energy contributes to off-target ZFN cleavage and suggest strategies for the improvement of future nuclease design. It was also observed that TALENs can achieve cleavage specificity similar to or higher than that observed in ZFNs.Des nucléases génétiquement modifiées (par exemple des nucléases à doigt de zinc (ZFN), des nucléases effectrices semblables à un activateur transcriptionnel (TALEN) et d'autres) constituent des outils prometteurs en vue de la manipulation du génome. En outre, la détermination de sites de clivage hors cible pour ces enzymes présente le plus grand intérêt. Nous avons mis au point une méthode de sélection in vitro qui interroge 1011 séquences d'ADN quant à leur capacité à être clivées par des nucléases dimères actives, par exemple des ZFN et des TALEN. Cette méthode a révélé des centaines de milliers de séquences d'ADN, dont certaines sont présentes dans le génome humain, et qui peuvent être clivées in vitro par deux ZFN, CCR5-224 et VF2468, qui ciblent, respectivement, les gènes endogènes humains CCR5 et VEGF-A.
