本发明提供了一种GyV7环形病毒VP3蛋白制备方法。该方法基于重组酶ExnaseTM II将线性化的pGEX‑6p‑1载体与GyV7病毒VP3基因片段PCR产物不经酶切连接反应,直接重组克隆技术;并转化到大肠杆菌,实现VP3蛋白表达;其中,用于PCR扩增GyV7病毒VP3基因的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。该方法操作简单、快速高效,获得的GyV7病毒VP3表达及纯化的蛋白,可直接提供VP3蛋白作为GyV7诊断抗原;作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体;为开展GyV7流行病学调查提供有效诊断试剂;并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。