本发明属于生物技术领域,提供一种抗酶解的抗菌肽II4II及其制备方法和应用。抗菌肽II4II的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。制备方法:以胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶的特异性酶切位点和抗菌肽的基本特征为基础,对序列中的氨基酸进行合理排列,选择Ile作为疏水性氨基酸,得出抗菌肽II4II。该抗菌肽II4II在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的胃肠道感染疾病药物中的应用。本发明的抗菌肽II4II对多种细菌具有较强的抑制作用,而且溶血活性较低,治疗指数达到80.63,而且具有较强的抗酶解能力,在胰蛋白酶或糜蛋白酶或胃蛋白酶处理后抑菌活性保持不变,具有成为抗生素替代品的应用潜力。