本发明涉及一种双功能转糖基α‑N‑乙酰氨基半乳糖苷酶及其表达基因与应用。该酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,双功能转糖基α‑N‑乙酰氨基半乳糖苷酶的表达基因,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述双功能α‑N‑乙酰氨基半乳糖苷酶可以高效合成Tn抗原和T抗原以及相应糖肽,所采用的α‑N‑乙酰氨基半乳糖苷酶在以丝氨酸、苏氨酸或短肽(STAPPA)为受体底物的反应体系中合成GalNAc‑α‑Ser/Thr、Galβ1‑3GalNAc‑α‑Ser/Thr和GalNAc/Galβ1‑3GalNAc‑α‑STAPPA糖缀合物的反应过程中,产率显著高于现有已知相关酶,具有潜在的应用前景。