本发明公开一种NPTII基因检测用引物组,所述引物组由外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP组成,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~4或SEQ ID NO:5~9所示。本发明所述引物组根据是否扩增就能判断靶标物质存在与否,具有高度特异性。本发明还公开一种检测NPTII基因的试剂盒,所述试剂盒包括以NPTII基因为靶基因、基于环介导等温扩增技术设计的两对引物:内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。所述试剂盒可以快速检测NPTII基因,只需一个恒定温度就能扩增,不需要特殊试剂或设备,检测成本低,而且灵敏度和特异性高。同时,本发明还公开了所述试剂盒的使用方法。