本发明提供了一种互换HA和NS1缺失基因包装信号的H9N2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用,属于疫苗技术领域。一种互换HA和NS1缺失基因包装信号的H9N2亚型禽流感病毒,包括重组NS‑HAmut‑NS和HA‑NS1‑128mut‑HA基因。所述重组NS‑HAmut‑NS和HA‑NS1‑128mut‑HA基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。利用本发明所述基因构建得到的重组H9N2亚型禽流感病毒能有效避免HA和NS片段与野生毒株发生重配,且具有减毒特性和良好的攻毒保护效力。