一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用,其载体由以下方法构建:A、以碱基序列为SEQ ID NO:1所示的(5’‑3’)引物与碱基序列为SEQ ID NO:2所示的(5’‑3’)引物,通过超保真DNA聚合酶,对pBHT2载体质粒进行扩增,得到含TrpC‑Hyp基因的核苷酸片段;B、用Hind III限制性内切酶和Pst I限制性内切酶对pGKO2载体进行酶切,得到线性化的pGKO2载体;再将含TrpC‑Hyp基因的核苷酸片段与线性化的pGKO2载体连接,即得。该载体用于丝状真菌基因敲除,可减少同源重组载体构建的步骤,提高阳性转化子的筛选效率,有利于真菌基因的功能研究和开发。