本发明公开了一种羊α干扰素突变体及其制备方法和应用。本发明首先公开了一种羊α干扰素突变体,其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。本发明将所述羊α干扰素突变体第54位氨基酸由赖氨酸(K)突变成谷氨酰胺(Q)得到氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的突变体,其抗病毒活性明显提高。本发明进一步将氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示突变体进行氨基酸单位点突变、双位点突变和多位点突变,获得多个抗病毒活性提高的羊α干扰素突变体。本发明利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达的所述羊α干扰素突变体的抗病毒活性大幅度提高。本发明提供的羊α干扰素突变体能够用于制备预防或治疗羊病毒性疾病的药物或试剂。