本发明公开了一种更安全的地中海贫血基因治疗载体、构建方法及其应用，属于基因工程技术领域；该载体包括自身失活的慢病毒载体序列和HBB编码多核苷酸基因序列的至少一部分，其中，所述自身失活的慢病毒载体为LentiCRISPv2，所述HBB编码多核苷酸基因序列如SEQ ID No.10所示；人工构建优化的lenti‑HBB血红蛋白真核表达载体可以诱导CD34+细胞向红系细胞分化，稳定表达血红蛋白链，是国内首次在体内外实验成功验证优化第三代lenti‑vector构建载体转染CD34+细胞向红系分化，为下一步进行重型β地中海贫血和血红蛋白病等其它造血系统紊乱血液病临床试验提供理论依据。
