本发明公开一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法;所述引物组包括引物对V.pa、引物对N.se和引物对P.da,所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~6所示;所述检测试剂盒包括上述检测引物组;所述检测方法运用上述检测试剂盒进行检测,先对样品进行前处理,并提取基因组DNA作为样品组DNA,再采用PCR方法对样品进行检测。本发明建立了一套三重PCR检测方法,可用于对各时期的副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌进行跟踪检测,避免病原菌传播流行,提高科学管理效率,具有很高的实用价值。