The present invention provides a method for preparing a protein conjugate from a protein having at least four accessible cysteine residues. In one embodiment, an antibody with four reducible disulfide linkages is reduced to yield four pairs of free cysteines. Each pair of free cysteines is reacted with 1,3-dihaloacetone or similar reagent to link each pair of sulfur atoms to each other via a three-carbon tether with a reactive ketone. A pair of these reactive ketones are linked together and used to bind a single payload molecule, thus conjugated the antibody to two payload groups. This method results in a stabilized antibody conjugate with high selectivity to the ratio of two payloads per antibody.本発明は、少なくとも４つの接触可能なシステイン残基を有するタンパク質からタンパク質コンジュゲートを調製する方法を提供する。一実施形態では、４つの還元可能なジスルフィド連結部を有する抗体を還元し、４対の遊離システインを得る。遊離システインの各対は１，３－ジハロアセトンまたは類似の反応剤と反応させて、各対の硫黄原子を、反応性ケトンを有する３炭素テザーを介して相互に連結する。一対のこれらの反応性ケトンは相互に連結し、単一のペイロード分子を結合するために使用され、したがって抗体を２つのペイロード基にコンジュゲートする。この方法は、抗体あたり２つのペイロードの比に対する高い選択性を有する安定化抗体コンジュゲートをもたらす。
