本申请公开了一种非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体及其制备方法和应用。本申请的制备方法,包括用纯化p54免疫蛋白对小鼠免疫,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞,用三种筛选抗原进行筛选,获得可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,再通过体内或体外的方法制备单克隆抗体;三种筛选抗原包括,原核表达p54重组蛋白、真核表达p54重组蛋白和人工合成的Seq ID No.1所示序列多肽。本申请,用三种筛选抗原对杂交瘤细胞进行筛选,特别是人工合成所有非洲猪瘟病毒毒株共有的多肽作为筛选抗原,使制备的通用单克隆抗体能够对不同地域来源的毒株进行检测,减小了毒株间地域差异造成的漏检现象,提高了检疫工作质量和效率。