本申请公开了一种非洲猪瘟病毒基因II型毒株单克隆抗体及其制备方法和应用。本申请的制备方法,包括用纯化p54免疫蛋白对小鼠免疫,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞,用三种筛选抗原进行筛选,获得可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,再通过体内或体外的方法制备单克隆抗体;三种筛选抗原包括,原核表达p54重组蛋白、真核表达p54重组蛋白和人工合成的Seq ID No.1所示多肽。本申请,用三种筛选抗原对杂交瘤细胞进行筛选,特别是人工合成特别针对基因II型毒株的多肽作为筛选抗原,使制备的单克隆抗体能够保障基因II型毒株的检测率,减小了漏检概率,提高了检疫工作质量和效率。