Disclosed herein are optimized guide RNA (gRNA) and methods of designing and using said optimized gRNA having increased target binding specificity and reduced off-target binding.本明細書で開示するのは、最適化されたガイドRNA(gRNA)、ならびに、標的結合特異性の増大とオフターゲット結合の低下を有する前記最適化されたgRNAを設計および使用する方法である。