一种来自灰黄链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因及其制备方法和应用,所述L-谷氨酸氧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,全长2004bp,其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明从土壤中筛选出一株产L-谷氨酸氧化酶的灰黄链霉菌,从该菌株中获得所述L-谷氨酸氧化酶基因的全长序列,得到核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的L-谷氨酸氧化酶基因,并利用基因合成方法合成出该L-谷氨酸氧化酶基因,大大降低了L-谷氨酸氧化酶从野生菌中提取的成本,提高了该L-谷氨酸氧化酶的催化活性,同时所述L-谷氨酸氧化酶底物专一性很强,能特异性地催化L-谷氨酸,可应用于L-谷氨酸含量检测,用于食品工业和临床生化检测领域。