本发明公开了一种鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及测序方法和专用引物。鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及测序用引物,见序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。扩增及其测序方法,包括以下步骤:(1)提取鸡羽毛中的DNA,并检测质量;(2)在鸡mtDNA Cyt b基因基因上下游保守区域设计一对所述PCR引物(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2);(3)利用测序引物(SEQ ID NO.3)对PCR产物进行测序;(4)对测序序列进行拼接。本发明的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点,所获得的mtDNA Cytb基因全序列可以应用于鸡遗传资源多样性评估、母系起源、系统进化分析和种质资源鉴定与保护等多个领域。