本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种同时靶标番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因,其筛选两种病毒基因组范围内的共同保守区域,分别针对PRSV和PLDMV的复制酶Nib和辅助成分蛋白基因Hc-Pro,按照PRSV-Nib1-PRSV-Nib2-PLDMV-Nib1-PLDMV-Nib2-PRSV-Hc-Pro-PLDMV-Hc-Pro的排列顺序,连接成总长为621 bp的基因序列,如SEQ ID NO.1所示。本发明还涉及一种同时靶标番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因的植物表达载体及其构建方法,所述的植物表达载体可用于基因枪或农杆菌介导的遗传转化,创造高效、广谱同时抗PRSV和PLDMV病毒病的新种质。所述方法用于构建RNAi表达载体时,能简化实验步骤,节省实验时间,并且提高RNAi植物表达载体的抗病毒效率。