一种用于检测猪瘟病毒疫苗毒C株的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒及其使用方法,所述试剂盒包含One Step RT-PCR buffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物及SEQ ID NO:3的探针引物的混合物,所述使用方法包括使用所述试剂盒进行RT-PCR扩增的步骤及评定标准。本发明弥补了CSFV鉴别诊断上的薄弱环节,建立并组装了特异性检测猪瘟C株疫苗株的实时定量RT-PCR试剂盒。与普通RT-PCR方法相比,本发明省时、省力,成本较低。本发明能够用于快速、敏感、准确以及低成本地对猪瘟病毒疫苗毒C株进行检测及定量分析。