A preparation of antibiotic hygromycin B with low cell toxicity and high purity, and methods of preparing such a preparation, are provided. More specifically, an isolated antibiotic hygromycin B with a purity of greater than 98% and impurities C, D and E individually less than 0.5% and impurity F less than 2%, as measured by HPLC, is described. Uses of this high purity antibiotic hygromycin B include, for example, for in vitro cell selection.La présente invention concerne une préparation dhygromycine B antibiotique présentant une faible toxicité cellulaire et une grande pureté, et des procédés de préparation dune telle préparation. Plus particulièrement, elle concerne une hygromycine B antibiotique isolée présentant une pureté supérieure à 98 % et des impuretés C, D et E individuellement inférieures à 0,5 % et une impureté F inférieure à 2 %, mesurées par CLHP. Les utilisations de cette hygromycine B antibiotique de grande pureté comprennent, par exemple, la sélection cellulaire in vitro.