本发明公开了一种抗菌肽Enterocin P的制备方法及其应用。本发明的抗菌肽Enterocin P基因,具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明的抗菌肽Enterocin P基因编码的成熟抗菌肽Enterocin P具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明的抗菌肽Enterocin P的制备方法,包括如下步骤:(1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因;(2)构建能高效表达重组质粒;(3)构建乳酸乳球菌NZ900的基因工程菌;(4)利用基因工程菌表达抗菌肽;(5)对抗菌肽的抑菌活性进行检测。本发明对病原菌具有较强的抑菌活性,安全无毒,无副作用。