本发明公开了抗菌多肽Pb2‑1或PCL‑1及其制备方法和应用,该抗菌多肽Pb2‑1和PCL‑1的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。本发明从缅甸蟒Python bivittatu来源的多肽CATHPb2出发,通过构效关系研究,获得α‑螺旋程度高的多肽Pb2‑1,并在其N‑端共价连接一段具有胰蛋白酶抑制活性的十一环肽,得到24个氨基酸组成的新结构多肽PCL‑1。本发明制备所得的多肽Pb2‑1和PCL‑1,其药效模块的α‑螺旋程度和疏水性提高;此外,PCL‑1连接十一环肽序列使多肽在具有良好体外抗菌活性的同时,对胰蛋白酶的稳定性也显著提高,其可应用于细菌和真菌感染性疾病的治疗。