The present invention relates to a two-photon fluorescent probe , it is more specifically represented by the formula (1) two-photon fluorescence probe , the present invention relates to a method of manufacturing the same and a method for imaging the mitochondria within the thiol using the same. By two-photon fluorescent probe according to the invention is introduced into the two probes in one molecule reacts with a thiol at the same time selectively staining the mitochondria represents a strong fluorescence , living cells or moderate image the distribution and activity of mitochondria in living tissue within a thiol you can . [Formula 1] In Formula 1, X is S or O.본 발명은 이광자 형광 프로브에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브, 그 제조 방법 및 이를 이용한 미토콘드리아 내 티올을 이미징 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이광자 형광 프로브는 한 분자 내에 두 개의 탐침을 도입시킴으로써 미토콘드리아에 선택적으로 염색됨과 동시에 티올과 반응하여 강한 형광을 나타내며, 생체 세포 또는 온건한 생체 조직에서 미토콘드리아 내 티올의 분포 및 활성을 이미징할 수 있다.[화학식 1]상기 화학식 1에서, X는 S 또는 O이다.