本发明公开了一种H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用。本发明的疫苗中含有由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述核苷酸序列用昆虫/杆状病毒表达系统表达后所得的重组病毒样颗粒蛋白和药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。本发明的重组病毒样颗粒与天然病毒粒子的形态结构类似,具有良好的免疫原性,由其制备得到的疫苗免疫小鼠后能够诱导小鼠产生良好的保护性免疫反应,且没有活病毒的任何危险,同时还能够区分自然感染者和免疫者,不干扰流行病学调查,因此,本发明的一种H3N8亚型马流感病毒样颗粒疫苗可以作为预防和治疗马流感的候选疫苗。