本发明提供了一种与长春新碱耐药性相关的microRNA分子miR‑663a及其应用,属于基因工程与肿瘤生物治疗技术领域。本发明miR‑663a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其具有在长春新碱耐药细胞中高表达、在长春新碱敏感细胞株低表达的特性,可作为长春新碱耐药标志物,用于制备针对结肠癌长春新碱耐药辅助诊断试剂盒,还为设计结肠癌长春新碱耐药药物提供了新的靶点。本发明提供了该miRNA标志物在制备用于治疗结肠癌的长春新碱耐药性辅助诊断试剂盒、筛选新的结肠癌治疗药物方面的应用,以及该miRNA抑制剂在制备拮抗长春新碱耐药药物中的应用,具有较好的临床应用价值。