本发明提供一种鉴定巴马火麻性别的方法及其使用的分子标记、引物对和试剂盒。所述分子标记是核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子,所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物,所述试剂盒包括所述引物对。本发明的用于鉴定巴马火麻性别的分子标记特异且稳定,只存在于雄性巴马火麻植株中,是一个新的分子标记。本发明的引物对、试剂盒可以用于鉴定巴马火麻的性别,且在苗期就可以进行,有利于在苗期人为的控制巴马火麻雌雄植株的比例以达到提高巴马火麻产量的目的。本发明的鉴定巴马火麻性别的方法操作简单、成本低廉,利于在实际生产中推广应用,具有很高的商业价值。