本发明涉及生物医药工程技术领域,提供了一种携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用。溶瘤痘苗病毒携带鲎凝集素基因,鲎凝集素基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示;溶瘤痘苗病毒的构建方法包括两个步骤:(A)将鲎凝集素的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒,获得pCB‑TTL质粒;(B)pCB‑TTL质粒和痘苗病毒通过在细胞内的重组,经筛选和鉴定后,获得携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒。本发明的溶瘤痘苗病毒不仅对多种肿瘤细胞具有显著抑制效果,而且能显著抑制肿瘤细胞的抗病毒因子水平和显著提高ERK磷酸化水平,有利于病毒复制;此外,携带TTL基因后溶瘤痘苗病毒的复制水平也显著提高。