The present invention relates to a method for detecting a fluorescent species (P) that is reversibly optically switchable at a high frequency, and more particularly, a method for detecting at least one reversible optically switched fluorescent species having a wavelength λ1. And the second illumination light beam (FEX2) having a wavelength λ2 different from λ1 and periodically modulated at the angular frequency ω, and the first illumination light beam (FEX1) periodically modulated at the angular frequency ω. And illuminating a sample containing the reversible light-switching fluorescent species, wherein the second illumination beam is modulated in antiphase with respect to the first illumination beam.本発明は、高周波数で可逆的に光スイッチング可能である蛍光種（Ｐ）を検出する方法に関し、より詳細には、少なくとも１つの可逆的光スイッチング蛍光種を検出する方法であって、波長λ１であり、且つ角周波数ωで周期的に変調される第１の照明光線（ＦＥＸ１）及び角周波数ωで周期的に変調される、λ１と異なる波長λ２の第２の照明光線（ＦＥＸ２）を用いて、可逆的光スイッチング蛍光種を含有する試料を照明することを含むステップを含み、第２の照明光線は、前記第１の照明光線に対して逆位相で変調される、方法に関する。
