The present invention provides a tissue regeneration substrate that is excellent in cell invasiveness and that can effectively prevent cell leakage from the tissue regeneration substrate and promote tissue regeneration, and the tissue regeneration substrate. It aims at providing the manufacturing method of. The present invention is a tissue regeneration substrate made of a nonwoven fabric made of a bioabsorbable material, wherein a layer made of a nonwoven fabric having an average pore size of 20 to 50 μm and a layer made of a nonwoven fabric having an average pore size of 5 to 20 μm are combined It is a tissue regeneration substrate having an integrated laminated structure.本発明は、細胞の侵入性に優れるとともに、組織再生基材からの細胞の漏出を効果的に防止して、組織の再生を促進することができる組織再生基材、及び、該組織再生基材の製造方法を提供することを目的とする。本発明は、生体吸収性材料からなる不織布からなる組織再生基材であって、平均孔径が20~50μmである不織布からなる層と、平均孔径が5~20μmである不織布からなる層とが複合一体化した積層構造を有する組織再生基材である。