一种用于新月柄杆菌高效快速基因组编辑的CRISPR/SpCas9M报告系统

• 全文链接

关键词：

来源：

中国科学院深圳先进技术研究院

全文链接：

//agri.nais.net.cn/topic/downloadFile/fc316cab-c4bc-4ed0-a31e-fed61aa8cfd4

来源地址：

https://www.siat.ac.cn/siatxww/kyjz/202505/t20250514_7652468.html

资源所属：

饲料用酶工程

类型：

前沿资讯

语种：

中文

原文发布日期：

2025-05-14

摘要：

近日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所赵国屏院士，赵维研究员团队联合上海交通大学在Nucleic Acids Research上发表题为“A CRISPR/SpCas9M-reporting system for efficient and rapid genome editing in Caulobacter crescentus”的方法论文，针对上述问题，开发了一套基于CRISPR/SpCas9M的基因编辑报告系统，实现了对新月柄杆菌高效、快速且无痕的基因编辑。该项工作不仅为新月柄杆菌的遗传操作提供了强有力的工具，也为解决其它难以进行遗传操作的非模式菌提供了新的技术思路和方法学参考。研究团队最初构建了一个基于同源重组（HR）的CRISPR/Cas系统。将Streptococcus pyogenes来源的SpCas9、sgRNA和同源臂（H-arms）克隆至携带pBBR1复制子的复制型质粒pBXMCS2中。为了实现无痕编辑，在同源臂之间未设计任何抗生素抗性基因。然而，将该编辑质粒电转化至新月柄杆菌后，发现获得极少甚至无菌落，并且存活菌株的靶位点均未发生预期编辑。这表明CRISPR/SpCas9的切割具有致死性，而该菌细胞内的同源重组（HR）效率又相对较低。为实现有效的靶向基因编辑，研究团队对编辑质粒进行了系统性分析，并围绕三个关键方向进行了优化。首先，研究人员筛选了来自不同物种的Cas蛋白，包括Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)、Francisella novicida Cas12a (FnCas12a), Streptococcus thermophilus CRISPR1-Cas9 (Sth1Cas9)和Streptococcus thermophilus CRISPR3-Cas9 (Sth3Cas9)，以评估它们在新月柄杆菌中的编辑效率，结果发现上述所有Cas蛋白均未检测到编辑克隆。然而，当根据新月柄杆菌的密码子偏好性优化SpCas9编码序列（命名为SpCas9M）后，基因编辑效率可达到15%左右。其次，研究团队通过调控SpCas9M的表达水平来提升编辑效率。研究人员测试了两种诱导型启动子，香草酸诱导型启动子（Pvan）和木糖诱导型启动子（Pxyl），检测不同诱导剂浓度下的基因编辑效率。结果发现相对较低的SpCas9M表达水平更有利于新月柄杆菌的基因组编辑，编辑效率最高可达到40%左右。最后，通过分析未发生基因组编辑的克隆中的编辑质粒，研究人员惊奇的发现这些克隆的SpCas9M编码序列均存在缺失。这一现象证实了CRISPR/SpCas9系统的致死性，并表明新月柄杆菌中存在着强烈的选择性压力。基于此，研究人员提出假设：通过预先识别并排除这些SpCas9M突变体，可有效提升在新月柄杆菌中的表观编辑效率。为此，研究人员在SpCas9M的C端融合了超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）作为报告系统，通过荧光信号指示，在菌落PCR前筛选并排除SpCas9M异常表达的克隆。最后，总体实现编辑效率达到80%左右，研究团队将其命名为CRISPR/SpCas9M-报告系统。