博德研究所与明尼苏达大学实现超大片段基因插入哺乳动物细胞

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关键词：

来源：

Nature Biomedical Engineering

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//agri.nais.net.cn/topic/downloadFile/b63a3046-8c5a-4994-8e6c-8cc61dfd4f96

来源地址：

https://doi.org/10.1038/s41551-024-01227-1

资源所属：

农业生物技术专题

类型：

学术文献

语种：

中文

原文发布日期：

2024-06-10

摘要：

2024年6月10日，Nature Biomedical Engineering在线发表了博德研究所David R. Liu和明尼苏达大学医学院Mark J. Osborn团队合作的最新研究进展：‘Efficient site-specific integration of large genes in mammalian cells via continuously evolved recombinases and prime editing’，本文通过进化的重组酶结合Prime Editor在哺乳动物细胞中实现大片段基因的高效位点特异性整合。称之为PASSIGE（prime-editing-assisted site-specific integrase gene editing）技术，其可精确整合大于10kb的DNA片段。通过噬菌体辅助连续进化（PACE）和非连续进化（PANCE）方法，研究团队对Bxb1重组酶进行了进化和改造，生成了具有更高整合效率的变体evoBxb1和eeBxb1。它们能够在人类细胞系中显著提高供体DNA的整合效率，高达60%，远高于野生型Bxb1的整合效率。这些变体在预安装了重组酶着陆位点的人类细胞系中表现出显著的整合效率提升。在单次转染实验中，使用eeBxb1的PASSIGE在安全港和治疗相关位点实现了平均23%的靶向基因整合效率，比野生型Bxb1高出4.2倍。在原代人类成纤维细胞中，整合效率在多个位点超过了30%。PASSIGE技术在多种基因整合位点上的表现均优于PASTE（programmable addition via site-specific targeting elements）技术。evoBxb1和eeBxb1变体的PASSIGE分别比PASTE高出9.1倍和16倍。通过连续进化和工程改造，Bxb1重组酶引入了多个突变位点，从而显著提升了其在哺乳动物细胞中进行大基因整合的效率。evoBxb1：引入突变点为V74A，在Bxb1重组酶的N端结构域（NTD）中引入的单一突变。eeBxb1：V74A，同样在NTD中引入的突变；E229K，在C端结构域-a（CTD-a）中引入的突变；V375I，在C端结构域-b（CTD-b）中引入的突变。这些突变的组合（特别是V74A、E229K和V375I）在eeBxb1中共同作用，显著提高了重组酶的整合效率。研究表明，这些突变可能通过优化活性位点构象或提高蛋白质稳定性来增强重组酶的活性。对比评估PASSIGE, evoPASSIGE, eePASSIGE和PASTE介导的定点插入能力。测试的基因位点包括与多种遗传疾病相关的基因，如CFTR（囊性纤维化）、GBA1（高雪氏病和帕金森病）、COL7A1（营养不良性大疱性表皮松解症）等。在HEK293T和N2a细胞中，利用PASSIGE、evoPASSIGE、eePASSIGE和PASTE技术，整合一个5.6 kb的DNA供体到上述治疗相关位点。结果显示，evoPASSIGE和eePASSIGE在所有测试的八个治疗相关位点上均表现出显著的整合效率提升。在这些位点上，eePASSIGE的平均整合效率达到22%，evoPASSIGE达到17%，而传统的PASSIGE仅为7.8%，PASTE为3.8%。在某些位点（如AAVS1、ACTB和FANCA），eePASSIGE的整合效率超过30%。其他位点（如B2M、GBA1、COL7A1、CFTR、Smn1、CCR5和ALB）的整合效率也超过20%。平均而言，evoPASSIGE和eePASSIGE相较于PASSIGE分别提高了2.7倍和4.2倍的整合效率。相较于PASTE，PASSIGE、evoPASSIGE和eePASSIGE分别提高了3.3倍、9.1倍和16.2倍的整合效率。（图2）通过高通量测序（HTS）评估整合后的基因组结果，发现evoPASSIGE和eePASSIGE的重组效率分别为59%和73%，显著高于PASSIGE的19%。这些结果表明，evoPASSIGE和eePASSIGE在多种治疗相关位点上均表现出高效的基因整合能力。这些改进后的PASSIGE变体在治疗相关基因位点上的高效整合，为未来的基因治疗应用提供了强有力的工具。本文通过优化和发展PASSIGE技术，突破了哺乳动物细胞基因组大片段定点整合效率的瓶颈，显著提升了大基因片段在哺乳动物细胞中的整合效率和精确度，为基因编辑、基因治疗和生物技术的应用提供了重要的技术支持和实验依据。