西南大学开发简单PAM识别的CRISPR-Mb3Cas12a植物编辑系统

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关键词：

来源：

Plant Biotechnology Journal

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//agri.nais.net.cn/topic/downloadFile/7de30bd9-5014-4c55-8280-9b319895ffc8

来源地址：

https://doi.org/10.1111/pbi.14486

资源所属：

农业生物技术专题

类型：

学术文献

语种：

英语

原文发布日期：

2024-10-10

摘要：

2024年10月10日，Plant Biotechnology Journal在线发表了由西南大学/电子科技大学张勇教授及其合作团队撰写的“PAM‐relaxed and temperature‐tolerant CRISPR‐Mb3Cas12a single transcript unit systems for efficient singular and multiplexed genome editing in rice, maize, and tomato”研究论文。该研究在对比测试了源于Helcococcus kunzii、Moraxella bovoculi、Pseudobutyrivibrio ruminis的CRISPR-HkCas12a、CRISPR-Mb3Cas12a, CRISPR-PrCas12a编辑活性及特性基础上，针对其中识别5’-TTV-3’简单PAM基序的Mb3Cas12a进行系统性工作，通过优化Mb3Cas12a核酸酶及crRNA骨架序列的关键功能元件及基序序列、核酸酶活性及稳定性相关关键氨基酸改造，构建了高效基于单转录单元（STU）的Mb3Cas12a植物基因组编辑系统。进一步应用工作中，在水稻、玉米及番茄中，实现了有效的蛋白编码基因敲除编辑、启动子调控序列编辑、microRNA功能性敲除编辑，丰富了植物基因组编辑工具箱。研究者首先基于所在团队之前开发的双Pol II启动子驱动的Cas12a植物基因组编辑骨架底盘，针对三个Cas12a同系物（HkCas12a、Mb3Cas12a、PrCas12a）构建了植物基因组编辑骨架载体。进而，基于“原生质体瞬时转化+扩增子通量测序”策略，在水稻细胞中评估了其在5’-VTTTV-3’ PAM位点和5’-VTTV-3’ PAM位点的编辑效率。实验结果表明：HkCas12a在5’-TTTC-3’和5’-TTTG-3’位点上显示较高编辑效率（36.4%-60.8%），但在5’-VTTTA-3’位点上效率较低（8.3%）；Mb3Cas12a在所有位点上显示40.0%以上的平均编辑效率，与LbCas12a相当；PrCas12a在5’-TTTG-3’位点上显示出较高编辑效率（>40.0%），但在5’-TTTA-3’和5’-VTTTC-3’位点上效率较低（3.9%-7.3%）。同时，在5’-VTTV-3’ PAM位点的编辑效率，Mb3Cas12a也在所有位点上显示了高效的编辑活性。进一步水稻稳定转化实验中，针对水稻内源基因，测试了Mb3Cas12a在3个5’-TTTV-3’ PAM位点和5个5’-TTV-3’ PAM位点的稳定编辑效率。实验结果表明，Mb3Cas12a在所有目标位点均实现了有效编辑，5’-TTTV-3’ PAM位点的编辑效率为70.0%-100%，5’-TTV-3’ PAM位点的编辑效率为20.0%-70.0%。进一步的通量编辑数据分析，发现HkCas12a、Mb3Cas12a及PrCas12a在水稻细胞中显示多样化的编辑特性：1）3个新Cas12a编辑工具诱导的突变主要是多碱基删除，且删除编辑事件为6bp-12bp的删除，删除位置在PAM远端13到27nt；3）使用存在碱基错配的spacer时，3种Cas12a除对PAM远端3bp的错配表现一定容错外，均体现了明确的高特异性；4）HkCas12a和Mb3Cas12a在crRNA长度为19到23nt时可以产生有效编辑，而PrCas12a需要更长的spacer来实现有效编辑。进一步，针对3个水稻内源基因靶位点（OsDEP1-crR1、OsROC5-crR2、OsmiR528-crR3），研究人员基构建、比较了单个Pol II启动子的STUHDH和双Pol II启动子的Dual Pol II多基因共编辑系统。稳定遗传转化单株的Sanger测序分析结果显示，基于双核酶的STUHDH和Dual Pol II系统具有相当的多重编辑效率，在所有靶位点上产生了94.1%-100%的突变。其中STUHDH系统的双等位基因编辑效率范围为41.2%-94.1%，与Dual Pol II系统相当（61.1%-94.4%），并且大多数植株在3个靶基因上产生了共编辑。考虑到基于双核酶的Mb3Cas12a STUHDH系统相较于Dual Pol II系统，具有结构简单、元件利用率高的优势，研究人员针对STUHDH系统进行进一步优化：1）优化了Mb3Cas12a和crRNA之间的linker序列，比较了Triplex、Comp.14以及初始STUHDH版本中的PolyA三种结构，发现PolyA在三种结构中表现突出（效率范围从23.7%-42.2%），Comp.14的编辑效率略低于PolyA（效率范围从12.1%-38.3%），而Triplex与PolyA相比编辑效率显著降低（效率范围从14.7%-27.1%）；2）优化NLS结构，比较了3C NLS（3x SV40 NLS位于Cas12aC端）、2C NLS（SV40 NLS-np NLS位于Cas12aC端）以及原始载体中使用的NC NLS（SV40 NLS与np NLS分别位于Cas12aN端和C端，发现NC NLS在三个系统中表现突出（效率范围从36.2%-69.1%），3C NLS的编辑效率略低于NC NLS（效率范围从32.5%-60.5%），而2C NLS总体上编辑效率较低（效率范围从8.5%-65.2%）；3）优化DR结构，分析了六个具有不同loop序列的DR（4n61、4n91、4n96、4n128、4n137、4n149）以及Mb3Cas12a的DR（Mb3 DR）在水稻内源位点上的编辑活性，发现4n96 DR在所有7个DR中效率最高（效率范围从17.3%-59.3%），4n61 DR和4n91 DR与Mb3 DR显示出相当的活性，编辑效率范围分别为9.6%-46.2%、10.9%-42.9%。综上结果，该研究通过使用PolyA、NC NLS和4n96 DR，开发了高效的Mb3Cas12a STUHDH植物基因组编辑系统。Cas12a核酸酶对低温敏感，研究人员进一步对Mb3Cas12a核酸酶D172、N573和K579关键氨基酸，设计了3个Mb3Cas12a变体，Mb3Cas12a-R（D172R）、Mb3Cas12a-RRR（D172R/N573R/K579R）、Mb3Cas12a-RVRR（N573R/K579V/N583R/K635R），并基于优化的STUHDH系统进行室温编辑能力评价。结果显示：32°C时，Mb3Cas12a、Mb3Cas12a-R和Mb3Cas12a-RRR显示出相当的编辑效率（平均效率分别为42.7%、43.0%和45.4%）；在28°C时，Mb3Cas12a显示编辑效率降低，而Mb3Cas12a-R和Mb3Cas12a-RRR在保持了高编辑效率；在22°C时，所有Mb3Cas12a基因组编辑效率均有下降，但Mb3Cas12a-R和Mb3Cas12a-RRR变体在大多数靶位点上显示了超过15.0%的编辑效率，比野生型Mb3Cas12a高出两倍。研究人员使用优化的Mb3Cas12a STUHDH系统针对水稻重要农艺性状相关基因进行启动子编辑。首先，针对OsGBSS1启动子设计了12个crRNA，对19个T0植株的分析显示，稳定转化材料在多个靶位点上实现了有效编辑，其中编辑事件为多碱基删除。进一步分析了五个纯合T1启动子编辑植株，这些植株携带了不同大小的删除，且启动子编辑水稻植株中OsGBSS1表达水平及籽粒中直链淀粉含量有效降低，其他主要农艺性状与WT植株相似。研究人员进一步针对水稻OsD18启动子设计了12个crRNA，基于优化的Mb3Cas12a STUHDH系统构建了OsD18启动子多重编辑系统，对18个T0株系的分析显示，稳定转化材料在靶位点上实现了多碱基删除有效编辑。对4个携带了不同大小删除的纯合T1水稻株系进行分析，发现这些启动子编辑株系中OsD18表达水平降低,植株呈现半矮化（平均高度从78.5cm-98.0cm，WT植物平均株高为106.0cm），除主穗的长度和主穗粒量有相对减少及分蘖数量增加外，OsD18启动子编辑株系的种子长度、千粒重和种子结实率没有显著变化。接下来，研究人员基于低温耐受的Mb3Cas12a-RRR核酸酶开发了玉米基因组编辑系统，通过玉米原生质体转化，分析了其在6个靶位点的编辑效率。其中2个位点显示了17.8%-28.6%的编辑效率，另外4个位点效率偏低（2.4%-4.6%），这表明spacer序列和基因组位置选择对玉米基因组编辑效率影响明显。同样，Mb3Cas12a-RRR在玉米中的编辑事件主要发生在PAM远端，且为8-11bp的多碱基删除。进一步，通过农杆菌介导的稳定转化方法研究人员创制了祥249（X249）玉米自交系的ZmMIR159f稳定编辑材料，在4株转基因阳性材料中，2株为多碱基删除（11bp-16bp）的编辑事件，且有效删除了ZmMIR159成熟序列区域，实现了基于Mb3Cas12a的玉米基因组非编码RNA基因的有效敲除。研究人员基于Mb3Cas12a-RRR核酸酶变体，开发了双子叶植物番茄基因组编辑工具，针对8个番茄内源靶向位点，对比了多种Cas12a编辑活性。结果显示，Mb3Cas12a-RRR在番茄中显示最佳编辑活性，所有靶位点的编辑效率均大于10.0%，编辑事件同样为多碱基删除。进一步基于Mb3Cas12a-RRR STUHDH系统，针对SlMYBATV-cR、SlGGP1-cR和SlCYCB-cR构建了多基因共编辑载体，通过农杆菌介导的稳定转化，随机选择25株转基因植株，进行Sanger测序和分析，发现SlMYBATV-cR、SlGGP1-cR和SlCYCB-cR位点的编辑效率分别为8.0%、12.0%和16.0%，双等位基因编辑效率分别为0%、12.0%和4.0%，三个基因的共编辑效率为4.0%，两个基因的共编辑效率为12.0%。481-5、481-10、481-11和481-16番茄共编辑植株果实中番茄红素含量显著增加。