加利福尼亚大学揭示二聚化ABE8e高效工作机制

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关键词：

来源：

Nucleic Acids Research

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//agri.nais.net.cn/topic/downloadFile/7c99c4ee-eac4-4ce4-a008-b19831708856

来源地址：

https://doi.org/10.1093/nar/gkae1066

资源所属：

农业生物技术专题

类型：

学术文献

语种：

英语

原文发布日期：

2024-11-21

摘要：

2024年11月21日，Nucleic Acids Research在线发表了加利福尼亚大学Giulia Palermo、Audrone Lapinaite团队合作的最新研究成果：‘Dimerization of the deaminase domain and locking int er actions with Cas9 boost base editing efficiency in ABE8e’，该研究通过分子动力学模拟、自由能计算以及生化和生物物理实验，深入分析了ABE8e的脱氨效率为何显著高于其前代ABE7.10。作者发现ABE8e的高效性依赖于TadA8e的稳定二聚化以及与Cas9和DNA非靶链（NTS）的“锁定”相互作用。TadA8e的二聚化显著增强了其催化效率，其中关键残基R98和R129通过分别与NTS和Cas9 RuvC区域形成稳定的结构桥，确保了ABE8e的高效DNA编辑。此外，他们的研究表明TadA8e的二聚化较其前体wt-TadA更为稳定，这一特性是ABE8e高效性的核心基础。通过对ABE8e与ABE7.10的突变比较分析，研究揭示了T111R和D119N等关键突变的功能作用。T111R虽然引起了结构的不稳定性，但显著提升了催化活性，而D119N作为补偿性突变恢复了酶的稳定性。这种功能性与稳定性的协同平衡推动了ABE8e的进化。此外，TadA8e的105–125环区突变（如D119N和H122N）减少了环的柔性，进一步稳定了二聚体并促进与Cas9-DNA的相互作用。TadA8e以二聚体形式存在，与失活的Cas9（dCas9）和靶DNA非靶链（NTS）形成复合物。TadA8e的两个单元具有功能分工：一个单元作为催化域（TadAcat），直接催化腺嘌呤的脱氨反应；另一个单元作为对接域（TadAdock），通过关键残基R98和R129分别与DNA非靶链和Cas9 RuvC结构域形成稳定的“锁定”相互作用。这种分工不仅显著增强了TadA8e的定位能力，还提高了其催化效率。当对接域中的R98突变为A（R98Adock）时，TadA8e无法有效与DNA非靶链结合，导致DNA脱氨效率显著下降；而催化域中的R98突变（R98Acat）基本不影响脱氨活性，说明R98的作用主要是通过对接域稳定TadA8e与目标位点的定位。同样地，R129在对接域中通过与Cas9 RuvC结构域形成电荷相互作用（如与E1049结合），显著提升了TadA8e的稳定性和DNA脱氨效率。当R129突变为E（R129Edock）时，脱氨效率明显降低，但引入Cas9补偿性突变E1049R可以恢复其活性，进一步确认了R129与Cas9直接相互作用的重要性。综上，ABE8e的高效碱基编辑能力依赖于TadA8e二聚化提供的稳定结构支持。定向进化过程中引入的突变（如T111R、D119N和H122N）不仅提升了催化活性，还通过减少105–125环区的柔性增强了二聚体的稳定性。二聚化的催化域和对接域分工明确，对接域通过R98和R129等关键残基优化了TadA8e与Cas9-DNA复合物的结合能力，从而显著提升了ABE8e的DNA脱氨效率。