明尼苏达大学优化FoMV载体递送sgRNA实现快速编辑高粱基因组

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关键词：

来源：

The Plant Journal

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//agri.nais.net.cn/topic/downloadFile/5968b6f7-7f54-47e6-ba68-bf2f289fe3fa

来源地址：

https://doi.org/10.1111/tpj.17196

资源所属：

农业生物技术专题

类型：

学术文献

语种：

英语

原文发布日期：

2024-12-11

摘要：

2024年12月11日，明尼苏达大学Daniel F. Voytas教授团队在The Plant Journal上发表了一篇题为“Rapid and efficient in plantagenome editing in sorghum using foxtail mosaic virus-mediated sgRNA delivery”的研究论文。该研究优化的狐尾花花叶病毒 (FoMV)载体能够直接感染高粱并在全株范围内传播，绕过了组织培养的过程，成功递送sgRNA至体细胞并诱导高频率的基因突变 (突变率最高达60%)，且产生了明显的表型变化。研究致力于提升病毒载体效率，评估狐尾花叶病毒 (FoMV) 和大麦条纹花叶病毒 (BSMV)在递送高粱基因组编辑所需荧光蛋白AmCyan和sgRNA方面的有效性。FoMV载体利用重复的衣壳蛋白启动子（dpCP）驱动来表达荧光蛋白AmCyan或sgRNA， BSMV则是通过在其γb基因组下游插入AmCyan或sgRNA (并在γb终止密码子后附加短连接序列，无需额外添加启动子序列) 来实现表达。所有FoMV和BSMV的病毒T-DNA均被设计为在35S启动子的调控下进行转录，荧光蛋白AmCyan和sgRNA的插入位点被视作病毒货物(Cargo) 。通过农杆菌侵染野生型本氏烟草叶片，成功从两种病毒基因组表达荧光蛋白AmCyan。七天后，在侵染的烟草叶片中检测到AmCyan的荧光信号，并制备病毒液以供进一步使用。用两种病毒液摩擦接种2周龄野生型BTx430高粱植株，结果显示：感染FoMV-AmCyan的高粱系统叶呈现强烈的绿色荧光，表明病毒成功感染和移动，而接种BSMV-AmCyan病毒汁液的高粱植株以及野生型对照叶均未检测到荧光。接种后，高粱系统叶中AmCyan信号初期微弱，后期增强，表明FoMV感染强烈。Western blot分析确认FoMV和BSMV病毒基因组均能表达AmCyan蛋白，但BSMV无法感染高粱，这些结果展示了AmCyan蛋白在两种病毒系统中的有效表达，适用于基于荧光的病毒感染和移动追踪应用。为了探索在高粱中使用FoMV介导的基因组编辑的可行性，将针对MgCh、Lw1、PDS基因 (这些酶的破坏会影响植物生产类胡萝卜素和叶绿素的能力) 的sgRNA序列整合到FoMV病毒基因组中。用携带FoMV构建的农杆菌接种本氏烟草植物以产生病毒液，再将病毒液接种到2周龄稳定过表达Cas9-GFP的转基因高粱植株的叶片上，实现了高粱中特定位点的基因组编辑，导致叶绿素生物合成受损和类胡萝卜素途径基因表达改变等表型变化。为了评估FoMV介导的高粱基因组编辑效率，在感染后45天从每株植物的第4、5、6片系统叶中采集了组织样本并进行PCR扩增和Sanger测序。结果表明在MgCh和Lw1目标区域，至少在三株独立植物中观察到了体细胞编辑，单株植物的突变效率最高达53%，所有FoMV-sgMgCh感染植物的平均突变率为40%，FoMV-sgLw1感染植物中编辑的体细胞最高比例为38%，平均突变率为30%。序列分析显示，突变主要为PAM上游3bp处的小缺失。相比之下，PDS目标区域的编辑仅在一株植物中检测到，且染色体1和6上的重复基因突变频率分别为20%和35%，大多数感染植物未能存活，推测可能与siRNA介导的基因沉默有关。通过摩擦接种实验发现，除导致致死表型的PDS靶向sgRNA外，其他sgRNA均可高效诱导高粱体细胞基因编辑。为进一步评估直接农杆菌接种方法的效率，使用替换PDS靶向sgRNA为GFP靶向sgRNA的FoMV构建体，并利用已知能将T-DNA转移到单子叶植物中的农杆菌GV3101菌株，将这些病毒载体传递到过表达Cas9-GFP的高粱幼苗中。在注射后5天，系统叶中观察到MgCh、Lw1和GFP的编辑，15天内出现特定于每种突变的表型。证明了直接农杆菌接种方法在高粱基因组编辑中的潜力，且该方法更高效，无需使用本氏烟草感染和病毒汁液制备。本研究证明了FoMV介导的高粱体内基因编辑，并强调了通过改进此方法为生成具有靶向修饰的后代植物提供机遇，无需组织培养或重复转化。但在本研究，由于病毒载体的运载能力，巨大的Cas9蛋白需要通过传统遗传转化方法提前转化进受体体内，这一步仍然是巨大的限制。如果能进一步改进FoMV病毒载体则有望培育无转基因高粱，实现可遗传基因编辑，这将极大推动高粱育种及开发优质品种。实现可遗传基因编辑将是一项重大突破，使高粱能够在世代间实现精确稳定的遗传改良。