德国分子生物学研究所开发BreakTag技术揭示DNA断裂特征

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关键词：

来源：

Nature Biotechnology

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来源地址：

https://doi.org/10.1038/s41587-024-02238-8

资源所属：

农业生物技术专题

类型：

学术文献

语种：

英语

原文发布日期：

2024-05-13

摘要：

2024年5月13日，Nature Biotechnology在线发表了德国分子生物学研究所Vassilis Roukos、Petra Beli团队合作的研究成果：‘Linking CRISPR–Cas9 double-strand break profiles to gene editing precision  with BreakTag’，本文介绍了一种名为BreakTag的新方法，用于全面分析CRISPR-Cas9诱导的DNA双链断裂（DSB）及其末端结构，以探究Cas9切割位点的决定因素。研究发现大约35%的SpCas9 DSB是错位的，这种错位切割与精确的、模板化的单碱基插入密切相关，从而展示了一种基于切割结构的gRNA设计策略，可以用于纠正临床相关的致病性单碱基缺失。BreakTag方法简介高效末端修复与加A尾：首先对Cas9处理后的基因组DNA进行末端修复和加A尾处理，准备进行接头连接。接头连接：将带有独特分子标识符（UMI）和样本条形码的接头连接到修复后的DNA末端。Tn5转座酶标签化：使用Tn5转座酶对连接了接头的DNA片段进行标签化，生成适合测序的片段。PCR扩增：对标签化的DNA片段进行PCR扩增，富集DSB片段并生成适合测序的文库。数据处理与分析：使用BreakInspectoR管道分析BreakTag数据，识别和计数Cas9诱导的DSB。BreakTag表征Cas9切割特性。研究团队设计并合成了约3500个sgRNA，这些sgRNA目标包括超过150000个内源性位点。利用SpCas9和多种工程化Cas9 变体（如 HiFiCas9、xCas9 等）对这些目标位点进行基因编辑，诱导DNA双链断裂。实验结果表明，钝端（blunt ends）占 61.57%；错位端（staggered ends）占 35.04%。图2显示了所有目标位点（on-target 和 off-target）以及 NGG PAM 位点的钝端和错位端的分布。错配的存在显著增加了错位切割的比例。，随着错配数的增加，钝端率下降，这表明部分互补的DNA和gRNA序列更容易产生错位切割。研究发现，Protospacer的特定位置的碱基组成对错位切割有显著影响。以上表明，部分互补的DNA和gRNA序列会影响Cas9的切割模式，偏向于产生错位的DSB。不同的Cas9变体在切割结构上表现出显著差异。例如，HiFiCas9和xCas9变体显示出更高的错位切割倾向。这表明，通过对Cas9蛋白的工程化改造，可以调控其切割模式，从而影响基因编辑的结果。