临港实验室与上交合作开发新型蛋白质组学方法APPLE-MS

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关键词：

来源：

Cell Reports Methods

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来源地址：

https://doi.org/10.1016/j.crmeth.2025.101166

资源所属：

农业生物技术专题

类型：

学术文献

语种：

英语

原文发布日期：

2025-09-15

摘要：

2025年9月15日，临港实验室江何伟团队与上海交通大学系统生物医学研究院陶生策团队合作，在Cell Reports Methods杂志上发表了题为Sensitive and specific affinity purification-mass spectrometry assistedby PafA-mediated proximity labeling的研究论文。该研究开发了一种新型蛋白质组学方法——APPLE-MS（Affinity Purification coupled Proximity LabEling-Mass Spectrometry），成功将Twin-Strep标签的高特异性富集能力与PafA介导的邻近标记技术相结合，实现在同一流程中高效、高灵敏度地捕获稳定及瞬时的蛋白质相互作用。APPLE-MS巧妙地利用了原核泛素样蛋白（Pup）标记系统中的PafA酶。该酶能够催化PupE共价标记邻近蛋白质。随后该技术通过Twin-Strep标签与链霉亲和素之间的高亲和力进行高效富集，实现在单一流程中完成PPIs的捕获与质谱鉴定。该方法不仅操作简便，还能在天然细胞环境下有效捕获传统AP-MS方法难以检测的弱相互作用（结合强度可达76μM）和膜蛋白复合物，其模块化设计允许在严格洗涤条件下通过共价连接稳定捕获瞬态互作，同时最小化对“bait”蛋白功能的干扰，显著提升了数据的可重复性和信噪比。研究团队通过多个模型系统验证了APPLE-MS的优越性能。在针对SARS-CoV-2 ORF9b蛋白的互作组的研究中，APPLE-MS成功鉴定出138个高置信度的相互作用蛋白，数量是传统AP-MS方法的4.07倍，并显著提高了信噪比。进一步的时间分辨分析揭示了ORF9B在抗病毒应答过程中动态调控线粒体代谢和免疫通路的作用机制，包括与RIG-I/MAVS信号通路关键组分（如RNF123和TUFM）的互作变化，以及该蛋白在不同感染阶段通过靶向TCA循环和氧化磷酸化复合物以重编程宿主代谢的策略，这些发现深入揭示了ORF9b作为多功能毒力枢纽的分子机制。此外，团队还利用CRISPR-Cas9技术在内源性PIN1蛋白中引入Twin-Strep标签，发现了PIN1在DNA复制和非编码RNA加工中的新功能，包括与MCM复合物和RFC1等复制体成分的相互作用。这些结果拓展了人们对PIN1在维持基因组稳定性和细胞周期调控中功能的认知，也展现了APPLE-MS在生理相关条件下研究内源性蛋白互作的能力。尤其值得关注的是，APPLE-MS成功应用于研究膜蛋白GLP-1受体的互作。通过在细胞表面原位进行邻近标记，该方法无需细胞裂解即可在天然膜环境下捕获互作事件。研究人员在INS-1E细胞中鉴定出301个潜在互作蛋白，包括多个已知和新型的共受体与信号组件，如ATP酶亚基和转运蛋白复合物。这些发现为理解GLP-1的血糖调控和其他生理功能中的作用提供了新视角，并展现出APPLE-MS在GPCR信号网络研究中的广泛应用潜力。综上所述，APPLE-MS技术兼具AP-MS的高特异性和邻近标记技术的高灵敏度，尤其适用于研究膜相关复合物和动态互作网络的研究。其小尺寸标签设计和通用酶系统使其可广泛应用于多种细胞类型，同时支持内源性标记和多重分析策略。该技术为疾病机制解析和新药靶点发现提供了强大工具，未来有望在更多生物学场景中发挥重要作用。