哥本哈根大学建立一种系统研究细胞中整体泛素化水平的研究方法

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关键词：

来源：

Cell

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来源地址：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.03.024

资源所属：

农业生物技术专题

类型：

学术文献

语种：

英语

原文发布日期：

2024-04-15

摘要：

近日，来自丹麦哥本哈根大学的Chunaram Choudhary带领团队在Cell杂志发表了他们最新的研究成果，题目是Global, site-resolved analysis of ubiquitylation occupancy and turnover rate reveals systems properties，他们建立一种系统研究细胞中整体泛素化水平的研究方法，并采用此方法对细胞中位点特异性泛素占有率以及更新速率进行了检测，发现了一些位点泛素化占有率和更新速率之间的联系。当用trypsin水解蛋白质时，ubiquitin，NEDD8和ISG15修饰的赖氨酸残基会留下一个Gly-Gly（GG）残留物，利用这个特点，研究人员建立了一种系统分析细胞中蛋白质泛素化水平的方法，此方法首先通过部分化学改性（partial chemical modification）对GG进行化学修饰，然后通过梯度稀释以及质谱检测成功建立了分析细胞样品中泛素化总水平的新方法。利用这种方法，研究人员对HeLa细胞的泛素化整体水平进行了分析，发现中位数以及平均泛素化占有率仅为0.0081%和0.059%。在可检测的所有位点中，仅有1%的位点泛素化占用率超过1%，而1.9%的位点泛素化占用率超过0.5%。研究人员比较了不同的翻译后修饰水平在细胞中的占用率，发现磷酸化修饰的占用率约为28%，远高于泛素化修饰，而N-糖基化修饰的占用率最高，有些位点近乎达到100%。除了占用率之外，翻译后修饰的更新速率同样非常重要。研究人员利用E1活化酶的抑制剂TAK-243处理细胞，然后检测不同时间点的泛素化水平。通过对24112个位点的泛素化水平变化的分析，研究人员发现泛素化更新可分为4个等级：半衰期小于5分钟的“非常快速”；半衰期在5-15分钟之间的“快速”；半衰期在15-60之间的“慢速”；半衰期大于60分钟的“非常慢”。分析结果显示，22%的位点泛素化更新半衰期小于5分钟，45%的位点泛素化更新半衰期小于10分钟，67%的位点泛素化更新半衰期小于30分钟。其他研究表明，mRNAs更新的半衰期为4-9小时，而蛋白质更新的半衰期为37-46小时，泛素化更新的速度远远超出mRNA和蛋白质的更新速度。接下来，研究人员对蛋白酶体介导的去泛素化进行了研究，应用蛋白酶体抑制剂MG132后，一些蛋白质的泛素化水平会增加，不过，研究人员先使用蛋白酶体抑制剂MG132，然后再使用E1抑制剂TAK-243，实验结果显示，MG132使整体泛素化水平上升，但随后TAK-243则降低了整体泛素化水平，说明一些蛋白质的去泛素化并不依赖于蛋白酶体的活性。之后，研究人员探究了所有可检测位点中，哪些位点的泛素化占用率最高，结果显示，占用率高于0.5%的位点主要与质膜（plasma membrane, PM）和跨膜（trans-membrane, TM）转运蛋白相关，在占用率前100的位点中，超过一半的位点存在于PM相关的TM受体上。另外，研究还表明，PM相关受体的胞内结构域比胞外结构域具有更高的泛素化占用率以及更长的半衰期。接下来，研究人员还检测了一些功能性泛素化位点的情况，比如涉及核糖体相关蛋白质质量控制（protein quality control, RQC）以及E1和E2自身的泛素化位点。结果表明，核糖体中的泛素化位点整体上具有较短的半衰期以及较低的占用率，且不会被蛋白酶体抑制剂诱导上调。不同的是，核糖体上与RQC相关的位点则表现出高占有率和短半衰期的特点。E1和E2酶的位点泛素化具有非常短的半衰期，约85%的位点的泛素化更新半衰期小于5分钟。最后，研究人员探究了蛋白质位点特异性泛素化占有率和半衰期之间的联系和差异，发现占有率高的位点泛素化倾向具有较长的半衰期，另外，占有率高的位点也倾向于不受到蛋白酶体抑制引起的泛素化水平上调影响。总之，本研究建立了一个系统评估细胞整体以及位点特异性泛素化水平的研究方法，发现了哺乳动物细胞中一些位点特异泛素化水平占用率和半衰期的特点，为理解哺乳动物的泛素化调控方式提供了新的观点和方法。