农业化学与食品技术研究所等合作通过改造TMV载体实现抗真菌蛋白的高效植物生产

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关键词：

来源：

Plant Biotechnology Journal

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//agri.nais.net.cn/topic/downloadFile/1d2860a9-9a4b-4077-a01b-2b4d03c82b64

来源地址：

https://doi.org/10.1111/pbi.70093

资源所属：

农业生物技术专题

类型：

学术文献

语种：

英语

原文发布日期：

2025-05-03

摘要：

2025年5月3日，农业化学与食品技术研究所（IATA-CSIC）和农业基因组学研究中心(CRAG, CSIC-IRTA-UAB-UB)在Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了题为“High yield production of the antifungal proteins PeAfpA and PdAfpB by vacuole targeting in a TMV-based expression vector”的研究论文。真菌作为重要的植物病原体，不仅导致作物减产，还因霉菌毒素污染威胁食品安全，而现有化学杀菌剂面临耐药性与毒性问题，亟需新型生物防治手段。抗真菌蛋白（AFPs）如 PeAfpA 和 PdAfpB，具高效抗真菌活性、稳定性及安全性，是理想的 “绿色生物杀菌剂” 候选分子。植物作为生产平台，具备可持续、适合二硫键蛋白折叠等优势，其中基于烟草花叶病毒（TMV）的瞬时表达系统可高效生产外源蛋白。此前研究通过质外体靶向提升 AFPs 产量，本研究进一步探索液泡靶向策略，旨在突破产量瓶颈，推动 AFPs 在农业病害防治中的应用。本研究通过改造烟草花叶病毒（TMV）的基因组，构建了一种高效且可控的植物表达系统。在TMV外壳蛋白（CP）编码区中，研究者巧妙设计了双信号肽策略——N端融合本氏烟渗透调节蛋白的AP24sp信号肽，引导目标蛋白（PeAfpA/PdAfpB）定向分泌至细胞外空间（apoplast），而C端引入烟草几丁质酶的液泡分选信号肽（VS），实现部分蛋白的液泡靶向转运。为确保蛋白高效表达与精准加工，研究保留了TMV的复制酶、运动蛋白等核心元件，使其在植物体内快速复制并系统性扩散；同时借助核酶序列（Ribozyme）实现目标蛋白的精确切割，避免病毒蛋白对宿主的潜在干扰。实验中，绿色荧光蛋白（GFP）作为阴性对照，用于动态监测病毒感染效率并排除非特异性信号干扰。这一系统创新性地整合了信号肽定向输送与病毒载体的天然优势，不仅突破了植物表达抗真菌蛋白的产量瓶颈，还通过亚细胞定位调控（如液泡隔离）解决了蛋白活性与宿主兼容性的矛盾，为后续功能验证及规模化应用奠定了关键技术基础。通过系统的Western blot和ELISA定量分析，本研究揭示了液泡靶向策略对抗真菌蛋白（AFP）表达效率的显著提升作用。数据显示，未添加液泡信号肽（VS）的PeAfpA在植物细胞外空间（apoplast）的表达量仅为12 μg/g鲜叶，而通过C端融合烟草几丁质酶的液泡分选信号肽（VS）后，其产量大幅提升至114 μg/g，增幅高达9倍。类似地，PdAfpB的液泡靶向版本产量达到1182 μg/g，较未修饰的细胞外表达形式（225 μg/g）增长3.5倍。这一突破性提升表明，液泡作为植物细胞内最大的储藏空间，能有效规避胞质蛋白酶的降解压力，同时利用其弱碱性环境维持蛋白稳定性，为高密度生产提供了新思路。值得注意的是，尽管定位策略不同，两类蛋白的抗真菌活性均未受显著影响。无论是细胞外分泌的AP24sp-PeAfpA还是液泡定位的AP24sp-PeAfpA-VS，其对灰霉菌（Botrytis cinerea）的最低抑菌浓度（MIC）均稳定在0.3-0.6 μg/mL范围内，与纯化自真菌的天然蛋白活性完全一致。这一结果证实，TMV载体介导的信号肽加工机制能够精准完成蛋白质翻译后修饰，保留关键半胱氨酸残基形成的三级结构，从而保障了蛋白功能的完整性。进一步的Western blot分析通过特异性抗体检测，直观展现了目标蛋白的高效表达。在SDS-PAGE胶中，AP24sp-PeAfpA-VS和AP24sp-PdAfpB-VS均呈现出清晰的条带，且Western blot验证了其分子量与理论预测值的高度吻合。尤为重要的是，免疫印迹信号强度与ELISA定量结果呈正相关，表明信号肽的引入并未导致蛋白降解或错误折叠，反而通过液泡隔离机制减少了宿主细胞对异源蛋白的应激反应。这种“表达-加工-功能”三位一体的优化策略，为后续开发基于植物工厂的绿色生物农药提供了重要的技术支撑。通过透射电镜（TEM）结合免疫金标记技术，首次揭示了抗真菌蛋白PdAfpB在植物细胞内的亚细胞命运。携带液泡分选信号肽（VS）的重组蛋AP24sp-PdAfpB-VS能够高效靶向中央大液泡，其信号集中分布于液泡腔内，仅少量残留于木质部导管，证实液泡作为植物细胞内最大的膜结合细胞器，为异源蛋白提供了稳定的储存环境与弱碱性微环境，有效避免了胞质中蛋白酶的降解作用；相比之下，未引入VS的PdAfpB（AP24sp-PdAfpB）则大量滞留于细胞质基质中，其异常积累可能引发宿主代谢紊乱，导致接种叶片出现萎蔫等胁迫表型，表明细胞质并非理想的异源蛋白表达场所；此外，绿色荧光蛋白（GFP）对照组中几乎未检测到特异性金颗粒信号，排除了抗体非特异性结合的干扰。这一发现从亚细胞层面阐明，液泡靶向策略不仅通过物理隔离大幅提升了蛋白积累效率，还降低了蛋白对宿主细胞的毒性压力，为植物“生物工厂”高效生产功能性蛋白提供了关键技术支撑，同时揭示了液泡在植物应对异源蛋白应激中的潜在调控作用。质谱分析结果表明，植物细胞对异源蛋白的翻译后修饰具有精准调控能力：AP24sp信号肽在AP24sp-PeAfpA中未被完全切除，其N端残留1-6个氨基酸片段，但并未显著影响蛋白活性，推测这些残留肽段可能在后续代谢过程中被逐步降解；而PdAfpB的VS信号肽则被液泡分选机制完全移除，验证了植物细胞对靶向信号的高效识别与处理能力。尤为重要的是，两种蛋白的成熟区（含6个保守半胱氨酸残基）均保持完整的三维结构，确保其抗真菌活性不受结构破坏影响。这一发现不仅证实了植物细胞器对异源蛋白的加工成熟能力，还为未来优化信号肽设计（如调整切割位点或增强分选效率）提供了关键依据，对提升植物生物反应器的蛋白表达效能具有重要意义。本研究通过工程化改造TMV载体，实现了抗真菌蛋白的高效植物生产。液泡靶向策略不仅提升了蛋白产量（最高达mg/g级），还通过亚细胞隔离降低了毒性风险。实验证明，植物提取物中的PeAfpA/PdAfpB可直接用于防治灰霉病、稻瘟病等多种真菌病害，活性媲美纯化蛋白。未来，这种“绿色生物农药”有望替代化学农药，为粮食安全和食品安全提供可持续解决方案