黄顶菊提取物及真菌源除草剂制备工艺的创新与应用

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获奖名称：

科技进步奖

获奖区域：

教育部

获奖等级：

二等奖

主要完成人：

董金皋; 张利辉; 张金林; 王惠; 贾慧; 邢继红; 王凤茹; 陶晡; 时翠平; 曹志艳; 刘颖超; 郝志敏; 司贺龙; 谷守芹; 康占海; 韩建民; 阎淑娟; 王艳辉; 张剑; 徐娇; 许文超; 闫建科; 高松梅; 曹宏哲; 董立新; 张宝军; 苏增朝; 柴同海; 柴彦; 李同增; 陈奇; 王保廷; 梅勤学; 李雪丽

关键词：

真菌;  制备工艺;  除草剂;  创新与应用;  黄顶菊;  工艺;  创新;  菊;  提取;  除草;  制备;  提取物; 

第一完成单位：

河北农业大学

获奖时间：

2012

项目名称：

生物源除草剂的创制理论及其应用;瓜果腐霉毒素除草作用机理研究

联系人：

张淑云

联系电话：

0312-7521305

电子邮件：

kjzzh@hebau.edu.cn

邮编：

地址：

河北省保定市灵雨寺街289号

合作完成单位：

单位电话：

0312-7528888;7521283

传真：

网址：

推荐单位(专家)：

摘要：

　　1、任务来源 　　本课题来源于国家863项目子课题：生物源除草剂的创制理论及其应用（2006AA10A214，2006-2010，经费8万元）；河北省自然科学基金项目：瓜果腐霉毒素除草作用机理研究（C2007000464，经费5万元）；河北农业大学将帅计划（经费45万元）；河北农业大学9816科技支撑计划（1期，2期，经费35万元），共投入经费93万元。本课题起始于2004年，全部内容完成于2010年12月。 　　2、应用领域和技术原理 　　课题属于应用研究，技术领域是：病虫草害防治技术。杂草是危害农作物的主要有害生物之一，虽然人们采用各种方式来防除杂草，但每年因草害使农作物造成的损失仍在10%~15%。近些年来，由于化学除草剂的大量开发和使用，引发了一系列问题，诸如除草剂对土壤的污染、对地下水的污染、对土壤微生物生态平衡的破坏、抗药性杂草种群的出现以及对非杂草生物（特别是人、畜）的危害等等。随着人们环境意识的增强和农业可持续发展的需要，除草剂的开发与研制象其他化学农药一样面临着来自各方面的压力和挑战。为此，开发环境相容性好、选择性强、生物活性高的除草剂已成为除草剂发展的必然趋势。 　　为了发掘新的先导化合物和确保新农药的环境安全，人们将天然活性物质作为新农药创新的思路。目前，生产和使用的天然活性物质中以微生物源和植物源居多，原因是这些农药具有活性相对较高、生产工艺简单、成本低、资源丰富等优点。 　　3、性能指标 　　本课题组自2004年开始进行研究，通过杂草学、农药学、化学、植物生理学、植物病理学等多学科协作研究，已超额完成计划任务指标，主要结果如下：①瓜果腐霉最佳的液体发酵条件是PD培养基、振荡方式、初始pH为5~7，最佳的固体发酵条件是麦麸加适量的蛋白胨；小孢拟盘多毛孢最佳的液体发酵条件PD培养基、15℃或30℃黑暗条件下，静置培养15 d，固体发酵试验发现玉米渣培养基、黑暗、30℃、静止培养8 d。②从瓜果腐霉的菌丝中分离得到了不饱和脂肪酸类活性化合物，从固体发酵产物中分离到了阿魏酸、2-（1-H-吲哚-3-基）丁酸乙酯、阿魏酸正丁酯和2-（1-H-吲哚-3-基）己酸乙酯；对小孢拟盘多毛孢粗毒素进行分离纯化，得到了一个纯度很高的单一除草活性组分Ⅲ；从黄顶菊的花中分离得到了具有较高除草活性4-（2-氨基丙酰胺基）- 3，4，5，6，7，8，9，10-八氢-5，6，8-三羟基-3-甲基异香豆素。③瓜果腐霉代谢产物处理后，马唐及蛋白核小球藻丙二醛含量、超氧自由基含量增高，水分含量降低、根系活力下降、希尔反应活力下降，且在光照条件对上述生理指标的影响强于黑暗处理；黄顶菊活性成份处理后，马唐的电导率增加、叶绿素含量、β-胡萝卜素含量降低、丙二醛含量增加。④研制的35%粗毒素水剂具有良好的稳定性和除草活性，对棉花田杂草具有较好的防除效果，施药后2d和3d的防效分别为78.5%和82.6%；30%的黄顶菊提取物乳油热贮和冷贮稳定性合格，5天防效在90%以上。 　　4、与国内外同类技术的比较 　　经科技文献检索和查新，除本课题研究论文外，国内外未见相同报道。本课题有以下突出特点：（1）从湖南张家界发病毛竹上分离到了一株强致病性的真菌，经形态学和分子生物学鉴定为小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora），并发现其代谢产物对马唐、狗尾草、虎尾草、播娘蒿、反枝苋等具有较强的除草活性，致死率均在80%以上；（2）首次从瓜果腐霉的固体发酵产物中分离得到了阿魏酸、2-（1-H-吲哚-3-基）丁酸乙酯、阿魏酸正丁酯、2-（1-H-吲哚-3-基）己酸乙酯；从黄顶菊中分离得到了4-（2-氨基丙酰胺基）- 3，4，5，6，7，8，9，10-八氢-5，6，8-三羟基-3-甲基异香豆素；（3）研制出了35%小孢拟盘多毛孢粗毒素水剂和30%的黄顶菊提取物乳油，试验结果表明两种剂型的稳定性合格。35%小孢拟盘多毛孢粗毒素水剂对棉花田杂草具有较好的防除效果，施药后2d和3d的防效分别为78.5%和82.6%，30%的黄顶菊提取物乳油对玉米田杂草除草效果明显，处理后5天的防效在90%以上。 　　5、成果的创造性和先进性 　　（1）对瓜果腐霉和小孢拟盘多毛孢进行了液体和固体发酵，优化了其发酵工艺。①利用PD培养基对PA1-M1菌株进行了液体发酵，比较了震荡和静置两种培养方式，以及培养滤液初始pH对菌丝干重以及培养滤液粗提物活性的影响，结果表明，振荡方式、初始pH为5~7时，菌丝的产生量最大，培养滤液的除草活性也强。对PA1-M1和PAC菌株的培养滤液粗提物进行了除草活性测定的结果表明，PA1-M1培养滤液粗提物对马唐根芽的IC50分别为0.36mg/mL和0.46mg/mL，PAC-M2培养滤液粗提物对反枝苋根和芽的IC50分别为0.49mg/mL和0.36mg/mL。且PA1-M1培养滤液粗提物对热稳定，对供试的马唐、反枝苋、藜等杂草均有一定的除草活性。两株菌株菌丝的除草活性结果表明，PA1-M1菌丝对马唐根和芽的IC50分别为7.36 mg/mL和4.09 mg/mL，PAC-M2菌丝粗提物对反枝苋根和芽和IC50分别为3.74 mg/mL和4.76 mg/mL。②利用麦麸、小米、大米、玉米等6种固体培养基质对瓜果腐霉的PA1-M1和PAC-M2菌株进行了固体发酵，经生物测定并结合HPLC和薄层层析，最终筛选出麦麸加适量的蛋白胨作为瓜果腐霉产生除草活性物质的最适培养基。③从湖南张家界发病毛竹上分离到了一株真菌，经形态学和分子生物学鉴定为毛竹的新致病菌--小孢拟盘多毛孢，并发现其代谢产物对马唐等具有较强的除草活性。研究明确了小孢拟盘多毛孢在加入硫酸亚铁的PD培养基中，15℃或30℃黑暗条件下，静置培养15 d，得到的除草活性物质最多；固体发酵试验发现玉米渣培养基（0.5 g葡萄糖）是产生除草活性物质的最适培养基。最适发酵条件为黑暗条件下30℃静止培养8 d。使用乙酸乙酯萃取的粗提物除草效果最好。 　　（2）从瓜果腐霉菌丝中分离到不饱和脂肪酸类化合物，从固体发酵产物中分离到阿魏酸及其衍生物等除草活性物质；对小孢拟盘多毛孢代谢产物进行了除草活性测定及活性物质的分离，获得了一个除草活性组分。①通过对8种极性不同的树脂进行系统的筛选，发现HPD500树脂对瓜果腐霉培养滤液中的除草活性组分的吸附能力最强；其最佳吸附条件为：吸附最适温度为20℃，树脂吸附饱和度为33.75mL/g，较适宜吸附流速为2BV/h，解吸附流速为1BV/h，洗脱剂浓度10%乙醇，洗脱剂用量为2.5BV。②利用柱层析和高效液相色谱法从瓜果腐霉的菌丝中分离得到了2个不饱和脂酸类化合物，其具有较强的除草活性；对瓜果腐霉PA1-M1菌株的固体发酵产物利用乙酸乙酯提取，TLC、硅胶柱层析和HPLC的方法，分离得到了化合物3、化合物4、化合物5和化合物6。 利用红外光谱（IR）、核磁共振波谱（NMR）、液质联用（LC-MS）技术对所得到化合物3~6进行了结构分析，确定了4种化合物的结构分别为阿魏酸、2-（1-H-吲哚-3-基）丁酸乙酯、阿魏酸正丁酯和2-（1-H-吲哚-3-基）己酸乙酯。③对小孢拟盘多毛孢的粗毒素进行了除草谱和作物安全性试验，结果表明其除草活性强，除草谱广，对玉米、棉花和青椒很安全，对大豆、黄瓜、西红柿等作物有轻微影响。利用树脂柱、TLC和HPLC方法对粗毒素进行分离纯化，得到了一个纯度很高的单一除草活性组分Ⅲ。④从黄顶菊的花中分离得到了具有较高除草活性的单体化合物，其分子量为248，结构为：4-（2-氨基丙酰胺基）-5，6，8-三羟基-3-甲基异香豆素，是具有除草活性的新结构类型。 　　（3）除草活性化合物的作用机理研究。①瓜果腐霉代谢产物处理马唐及蛋白核小球藻后，供试植物的丙二醛含量，超氧自由基含量增高，水分含量降低，根系活力下降、希尔反应活力下降，由此可以初步推断杂草的光合作用以及水分代谢受到影响；多年生黑麦草经瓜果腐霉除草活性组分处理后叶绿素荧光参数发生了变化，Fm均随除草活性组分剂量的增加而降低，说明PSⅡ的电子传递受到了影响，Fo的上升，表明PSⅡ反应中心受到破坏或发生可逆失活。②用不同浓度的黄顶菊活性成份处理马唐后分别在光照和黑暗条件下进行培养，通过测定电导率、叶绿素含量、β-胡萝卜素含量、丙二醛含量、超氧自由基含量发现，该成份对马唐的作用机制主要是影响其光合作用：随着活性成份浓度的增高，其电导率也随之增加、叶绿素含量β-胡萝卜素含量降低、丙二醛含量增加。 　　（4）研制出了35%小孢拟盘多毛孢代谢物水剂和30%的黄顶菊提取物乳油。①拟盘多毛孢代谢物对玉米、棉花、青椒安全，可以用来防除玉米田和棉花田杂草。通过对拟盘多毛孢代谢物剂型的探索，发现35%拟盘多毛孢粗代谢物水剂具有良好的稳定性和除草活性。田间试验结果表明，35%拟盘多毛孢代谢物水剂对棉田杂草具有较好的防除效果，施药后2d和3d的防效分别为78.5%和82.6%。②将黄顶菊提取物加工成5%、30%和50%的除草剂乳油，结果表明30%的乳油具有较好的除草活性，其热贮和冷贮稳定性合格。田间药效试验表明其对玉米田杂草具有较好的防除效果，5天防效在90%以上，但试验发现该乳油对供试的玉米品种有轻微的药害，受药害后5～7天即可恢复。 　　6、经济和社会效益 　　本项目从微生物除草剂和植物源除草剂的研发入手，在本实验室多年工作基础上进行的，主要对瓜果腐霉和小孢拟盘多毛孢两种植物病原真菌的发酵工艺、除草活性组分的分离纯化及结构鉴定，以及黄顶菊中除草活性物质的分离、鉴定及除草机制进行了系统的研究，同时对生物除草剂的剂型进行了探索和研制，并在河北省邢台、沧州、衡水、秦皇岛等市县进行应用，共示范推广11.2万亩，新增纯收益1167万元。 　　课题的研究成果为生物农药的研发提供了翔实的科研数据和指导意义。课题组成员《Agricultural Sciences in China》、《离子交换与吸附》、《微生物学报》、《植物保护学报》等刊物上发表学术论文17篇，其中SCI、EI和ISTP收录各1篇；获得国家发明专利2项 。