蚯蚓抗菌肽研究

• 收藏
• 分享

获奖名称：

科学技术奖

获奖区域：

北京市

获奖等级：

三等奖

主要完成人：

孙振钧; 王冲; 刘艳琴; 张希春; 马永良; 孙永明; 乔玉辉; 程文玲; 刁晓平; 徐国珍; 刘雪连

关键词：

抗菌肽;  抗菌;  研究;  蚯蚓;  肽; 

第一完成单位：

中国农业大学

获奖时间：

2007

项目名称：

联系人：

孙振钧

联系电话：

010-62732942;62736518

电子邮件：

sun108@cau.edu.cn

邮编：

地址：

北京市海淀区圆明园西路2号

合作完成单位：

单位电话：

010-62731053

传真：

010-62732713

网址：

推荐单位(专家)：

中华人民共和国教育部

摘要：

1、任务来源 本项目主要来源于以下国家自然科学基金项目和高等学校博士点基金资助项目：“饵料诱导下蚯蚓择食行为与蚓体活性蛋白的关系与机理”（国家自然科学基金项目，39770105)；“蚯蚓抗菌肽的定向诱导与生态调控机理”（国家自然科学基金项目，30270195)；“蚯蚓生态免疫系统与功能分工”（国家自然科学基金项目，30470220）；“蚯蚓抗菌肽的饵料诱导与调控机理”（高等学校博士点基金资助项目，98103)；“应激蚯蚓抗菌肽的产生、特性及蚯蚓的生态适应性机理”（高等学校博士点基金资助项目，20020019029)。 应用领域与技术原理 蚯蚓在土壤生态系统中起重要作用，蚯蚓与土壤微生物及其它生物间的相互作用构成了土壤生态系统内稳定的生物学基础。蚯蚓体内免疫物质的产生、分泌，对保持改变土壤有益生物与有害生物的平衡有重要作用，而这种平衡作用对植物的抗病性与生长发育有着重要的影响，因此探询蚯蚓的抗病机制，开发蚯蚓抗菌肽作为氨基酸农药对植物病害进行防治，对环境无污染，而且由于其本身含有大量的氨基酸，对植物生长有明显的促进或增产效果。此外，蚯蚓抗菌肽的进一步筛选将逐渐开拓蚯蚓在医药领域的应用前景。 性能指标 　　EP1：运用热处理结合超滤法对蚯蚓（Eisenia foetida）体液抗菌物质进行了初步分离，得到分子量小于10kd，热稳定性强的抗菌物质A３。用分子筛柱层析方法在Sephedax G-25柱上，从A３中分离出抗菌物质A３-４，经离子交换柱层析从A３-４ 中分离出抗菌物质A３-４-２。A３-４-２脱盐后，经HPLC检验，证明已纯化。A３-４-２ 经链霉蛋白酶E消化试验证明，为多肽类，氨基酸成分分析得知，由11种、40个氨基酸残基组成。其中酸性氨基酸占30%，甘氨酸含量占25%，计算分子量为4538Da，表明A３-４-２是一种富含甘氨酸的酸性四十肽，命名为EP1。EP1的抗菌谱广、抗菌活力强、理化性质比较稳定。 　　表现在： 1)用不同pH溶液处理时，除pH1时抗菌物质失活外，pH为3， 5， 7， 9， 11时对抗菌物质活力影响很小； 2)沸水浴处理，提取液中大部分蛋白质失活而沉淀下来，抗菌物质却损失很少，具有很好的热稳定性； 3)蚯蚓提取液中抗菌物质室温放置180天仍具有抑菌活性等。但随着抗菌肽逐步分离纯化，一些与肽结合的物质丢失，其理化特性和抑菌活性发生变化，抗菌肽较提取液中抗菌物质抗菌活力明显下降。 　　EP4：通过硫酸铵沉淀和超滤等，将蚯蚓匀浆分成6个粗组分，即30%～60%硫酸铵沉淀大于10KDa（Ⅰ），10KDa～1KDa（Ⅱ）及小于1KDa（Ⅲ）三组，60%～90%硫酸铵沉淀大于10KDa（Ⅳ）、10KDa～1KDa（Ⅴ）及小于1KDa（Ⅵ）三组。通过抑菌圈法和微量稀释法检测抗菌活性，结果表明，除Ⅳ组、Ⅵ组外均有一定抗菌活性。其中分子量较小的Ⅱ组对所选5种测试菌中的4种即腐生葡萄球菌Staphylococcus sarophyticus、肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae pneumoniae、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和大肠杆菌Escherichia coli有抗菌活性，Ⅲ组则对选用的5种测试菌白色念株菌Candida albicans、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠杆菌Escherichia coli、粘质沙雷菌Serratia marcescens和产酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca都有活性。 这两组表现了相对较广的抗菌作用。另外，Ⅴ组经Q SepharoseTM High Performance阴离子交换进一步分离的结果表明，Ⅴ组中存在pH7.6的Tris缓冲体系中带负电荷的活性成分。而且还表明Ⅴ组分对MGC803胃癌细胞也有杀伤作用。EP2、EP3的分离纯化及部分特性：在初步筛选的基础上又经硫酸铵沉淀、超滤、阳离子交换分离和反相FPLC，得到了两种新的蚯蚓抗菌肽 EP2与 EP3。分子量经电喷雾离子源质谱（ESI-MS）测定为 535.27 Da和519.27 Da。串联质谱（MS/MS）数据表明EP2的肽序列为Ac-Ala-Met-Val-Ser-Ser，EP3的肽序列为Ac-Ala-Met-Val-Gly-Thr。利用 MTT 法和扫描电镜，对EP2与 EP3 对体外培养的MGC803胃癌细胞的杀伤作用及其机理进行了研究，结果表明EP2与 EP3 对MGC803都有杀伤作用（P＜0.05)。经EP2或EP3作用后，用扫描电镜可以观察到MGC803胃癌细胞从球形变成不规则的形状，表面原有的突起减少且大小不一，分布不均。EP2与 EP3对体外培养的癌细胞发挥作用需达到一定的样品浓度和作用时间。ECP5-1的分离纯化及部分特性：用常规硫酸铵沉淀法和超滤法对体腔液进行了初步分离，得到了分子量分别为大于10kDa、1kDa-10kDa、小于1kDa的三种组分（ECP1、ECP2、ECP3)。研究了ECP3对PRV和HeLa 细胞的作用。 　　结果显示： ECP3抗PRV作用具有剂量效应和一定的时间效应。ECP3浓度越大细胞病变程度越轻。各浓度组在72小时的细胞病变程度最轻。与EC的直接杀病毒作用不同，ECP3抗PRV的机理为抑制病毒DNA的复制。ECP3可以诱导HeLa细胞凋亡， 其诱导凋亡作用与浓度有关。本研究结果显示，ECP3诱导HeLa细胞凋亡的阈值为0.75mg/mL，凋亡率为48.12%。创立了硫酸铵沉淀-超滤-DE52离子交换层析-Sephadex G-10凝胶过滤和C18反相高压液相5个步骤分离纯化工艺。 利用该法获得了一种全新抗菌寡肽ECP5-1。利用C18 HPLC测定了ECP5-1纯度，结果其峰面积达90.27%，ECP5-1已经达到了高压液相级纯度。MALDI法测定ECP5-1的分子量为510.8Da；MS/ MS分析ECP5-1的氨基酸序列为Ala-Cys-Ser-Ala-Gly。ECP5-1对绿脓杆菌的MIC为16.5mg/L，无溶血特性。ESP-1的分离纯化及部分特性：用经过Sephadex G-75， G-50， G-25三步层析从蚯蚓的体表粘液中分离到具有抗菌活性的抗菌肽粗品ESP，再经过反相高效液相色谱纯化后，得到了一种全新的蚯蚓抗菌肽ESP-1。分析结果ESP是由16种氨基酸的58个残基组成，其中丝氨酸（Ser）残基最多，为16个。经基质辅助激光解吸离子化(MALDI)和飞行时间质谱仪(TTOF/MS)相结合的方法测得ESP-1的分子量为5814.32。探讨了蚯蚓饵料与抗菌肽的关系： 选出了蚯蚓抗菌物质的有效诱导方法。用自然诱导物料 (高铜动物粪便、高氮屠宰场下脚料，高植酸磷作物秸秆料和富硒矿土)做饵料成分用于诱导蚯蚓产生抗菌物质，各处理间差异均不明显。既没有明显的诱导作用；用生物处理(大肠杆菌)、物理处理(γ射线、超声波、电振动、机械损伤)和化学处理(重金属、EDTA、Cys、DLMT)诱导蚯蚓产生抗菌物质， 　　结果表明： 1)几乎各种诱导源均可诱导获得抗菌物质，但诱导效果差异较大。以大肠杆菌活体注射、机械损伤、重金属拌料诱导方法，诱导效果较好。在极限忍受范围内，随着刺激强度增加，抗菌物质活性提高。 2)不同诱导源产生抗菌物质的组分有明显差异。 大肠杆菌处理和DLMT处理，主要作用于抗菌物A3；物理处理主要作用于抗菌物A2；EDTA主要影响抗菌物A1，而重金属镉则对抗菌物A3，Ａ2，Ａ1均有影响。实验表明，用不同诱导源可望定向诱导不同的抗菌物质。同时，确立了饵料环境中重金属与蚯蚓活性酶（肽）的关系并建立了利用蚯蚓同工酶和蚯蚓抗菌肽监测土壤重金属污染的方法。本研究证明，重金属可定向诱导蚯蚓同工酶和抗菌肽的变化。蚯蚓对重金属刺激的忍受(诱导强度)接近极限值时，诱导效果最好，低强度的刺激不易起动蚯蚓的应答反应，没有诱导效果。重金属镉常引起土壤污染，也表现出较强诱导作用。蚯蚓具有抗重金属与富集重金属的作用，并且对重金属抗性可通过与重金属的接触而逐渐提高。蚯蚓对重金属的这种应答反应在环保上有着特殊生物学意义。有趣的是一些对动植物有益的微量元素（铜、硒）不仅是一种良好的诱导剂，并表现良好的富集重金属的作用。这为利用蚯蚓富集有益的有机微量元素进而开发新型功能食品开辟了新途径。 　　成果的创造性、先进性理论上的突破点：首次在国内外提出并验证了两个假设： 1)肽类物质可能是蚯蚓体液抗菌系统的抗菌成分； 2)蚯蚓抗菌肽(蛋白)可以诱导获得并具有非专一性的免疫应答。 方法上的突破点：本课题建立的蚯蚓抗菌肽分离纯化方法，简便易行，收获率和纯度高，已经获得发明专利。采用单一因子分析与综合因子协调分析相结合的方法，结构与功能综合分析的方法，损伤刺激（切断）和无损伤刺激（震动和重金属处理）辨证分析的方法，阐明了外界生存环境变化与体内蚯蚓抗菌肽表达的生态学机理-扳机原理。验证了“蚯蚓抗菌肽(蛋白)可以诱导获得并具有非专一性的免疫应答”这一假设。 　　研究成果上的突破点：自1995年首次从蚯蚓(Eisenia foetida)体中证实蚯蚓抗菌肽的存在并分离出一种具有广谱抗菌作用的酸性四十肽后，由相继从蚯蚓的组织匀浆液、体腔液和体表粘液中分离纯化出另外6种抗菌肽，从而进一步证明了“肽类物质可能是蚯蚓体液抗菌系统的抗菌成分”这一假设。同时根据现有本实验室已经发现的几种抗菌寡肽的结构特点，首次提出了蚯蚓抗菌肽的一个家族-具有Ala-Met-Val-Ser-Gly 的5～7个氨基酸组成抗菌寡肽族，命名为：vermipeptides family。命名 结构序列 氨基酸残基数 分子量(Da） 来源 抗菌特性： EP1 / 40 4832 蚯蚓自溶液 抗细菌和真菌。 EP2 Ac-Ala-Met-Val-Ser-Ser 6 535.27 蚯蚓组织匀浆液 以抗细菌为主。 EP3 Ac-Ala-Met-Val-Gly-Thr 6 519.27 蚯蚓组织匀浆液 以抗细菌为主。 EP4 / / 约20000 蚯蚓组织匀浆液 以抗细菌为主。 ECP5-1 Ala-Cys-Ser-Ala-Gly 5 510.80 蚯蚓体腔液 以抗细菌为主。 ESP-1 / 50 5814.32 蚯蚓体表粘液 以抗细菌为主。