林氏扇头蜱几丁质酶基因RLCht1差异表达分析及酶活性检测

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作   者：

李尧;  赵培真;  谢子芳;  彭维祺;  陈杰;  赵建国;  管庆丰; 

作者机构：

海南大学生命健康学院; 

关键词：

酶活性检测;  林氏扇头蜱;  原核表达;  包涵体;  表达谱; 

期刊名称：

中国畜牧兽医

i s s n：

1671-7236

年卷期：

2024 年 51 卷 011 期

页   码：

4964-4973

摘   要：

【目的】蜱的蜕皮发育过程与几丁质合成和水解紧密相关，而几丁质的降解主要是通过几丁质酶来完成。试验旨在分析林氏扇头蜱(Rhipicephalus linnaei)不同时期及各组织中几丁质酶RLCht1基因序列表达差异、体外异源表达RLCht1蛋白并验证其几丁质酶活性，为开发安全高效的生物杀蜱剂提供新型靶标思路。【方法】收集不同吸血状态的各时期蜱及雌性饱血成蜱的不同组织样本用于基因差异表达分析，基于血红扇头蜱合神经节转录组中筛选出的推测的几丁质酶(putative chitinase)序列，在林氏扇头蜱中进行扩增并构建重组原核质粒，使用大肠杆菌系统表达林氏扇头蜱几丁质酶蛋白RLCht1,进行包涵体处理后使用镍柱纯化蛋白，预测RLCht1蛋白结构域；通过与3种不同荧光底物发生催化反应，检测纯化的几丁质酶RLCht1的催化活性大小及作用方式。【结果】RLCht1基因在不同饱血状态下的各个时期及饱血雌成蜱的不同组织中均有表达，饱血若蜱阶段表达量极显著高于卵期(P<0.01),显著高于其他时期(P<0.05),并在饱血雌性成蜱中肠内有较高的表达量；构建了重组质粒RLCht1-pET-28a并成功表达RLCht1蛋白，经包涵体处理后在150 mmol/L咪唑洗脱下得到纯化的RLCht1蛋白，蛋白预测结果显示，RLCht1属于GH18家族几丁质酶；荧光底物酶活性检测表明，RLCht1包涵体溶解液、复性未纯化的原核蛋白、复性纯化浓缩后原核蛋白分别具有0.078与0.350 U/mL的几丁质外切酶活性及0.034 U/mL β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性。【结论】RLCht1基因与若蜱至成蜱阶段的蜕皮活动相关，影响与免疫、消化、体液调节有关的生命活动过程。本研究在林氏扇头蜱中成功表达几丁质酶蛋白，证明了纯化的RLCht1蛋白具有几丁质催化功能，为林氏扇头蜱几丁质酶RLCht1蛋白在今后杀蜱剂开发中的应用提供了理论基础。