库京病毒TaqMan荧光RT-PCR检测方法的建立

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作   者：

刘梦莹;  许士奇;  孙肖红; 

作者机构：

中国检验检疫科学研究院;  承德医学院病原生物学教研室; 

关键词：

方法;  库京病毒;  检测;  TaqMan荧光RT-PCR; 

期刊名称：

中国病原生物学杂志

基金项目：

i s s n：

1673-5234

年卷期：

2015 年 07 期

页   码：

594-597

摘   要：

目的库京病毒(Kunjin virus,KUNV)为黄病毒属病毒,是西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的亚型。由于我国存在其流行的生态学条件,传入的风险很大。因此,亟待建立快速、灵敏、高效的TaqMan荧光RT-PCR方法用于国境口岸KUNV的监测,防止其传入。方法从GenBank中检索KUNV全基因序列,通过MEGA 4软件进行序列比对和Blast进行保守序列搜索分析,选取E基因片段为模板。利用Beacon Designer 7.0软件针对模板设计引物和探针,进行TaqMan荧光RT-PCR检测并优化反应条件和引物浓度,退火温度设定为50、55、60℃,引物终浓度设定为200、400、800nmol/L,探针终浓度设定为100、200、400nmol/L,通过扩增曲线与Ct值分析确定最佳退火温度、最佳引物及探针终浓度并验证该方法的敏感性和特异性。结果通过分析比较,确定KUNV荧光RT-PCR检测方法最佳退火温度为55℃,引物终浓度为400nmol/L,探针终浓度为200nmol/L。该方法检测KUNV核酸的敏感度达1.83×102copies/μl,且与正布尼亚病毒属拉克罗斯病毒(La Crosse virus,LACV)、雪靴野兔病毒(Snowshoe hare virus,SSHV),甲病毒属巴马哈森林病毒(Barmah Forest virus,BFV)、马雅罗病毒(Mayaro virus,MAYV),黄病毒属乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、黄热病毒(Yellow fever virus,YFV),东南亚十二节段RNA病毒属版纳病毒(Banna virus,BAV)均无交叉反应。结论建立的TaqMan荧光RT-PCR方法灵敏度高、特异性好,适合于KUNV的快速检测,具有应用价值。