基于牛流行热病毒G蛋白的免疫胶体金检测方法的建立

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作   者：

王雪妍;  靳双媛;  杜家伟;  温宏武;  李永琴;  许立华; 

作者机构：

宁夏吴忠市盐池县农业农村局畜牧技术推广服务中心;  宁夏大学; 

关键词：

原核表达;  牛流行热病毒(BEFV);  G蛋白;  蛋白纯化;  免疫胶体金; 

期刊名称：

中国畜牧兽医

i s s n：

1671-7236

年卷期：

2024 年 51 卷 010 期

页   码：

4429-4439

摘   要：

[目的]建立牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus,BEFV)的免疫胶体金检测方法,为牛流行热(BEF)诊断提供研究基础.[方法]构建原核表达载体pET32a-BEFV-G,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行表达,对诱导成功后的表达产物进行纯化和SDS-PAGE、Western blotting鉴定.以纯化后的蛋白作为特异性抗原包被检测线,以链球菌G蛋白作为金标抗原,与金纳米颗粒结合后标记在金标垫上,用羊抗鼠IgG作为质控线,通过优化不同的反应条件,建立检测BEFV的免疫胶体金检测方法,并对试纸条进行敏感性、特异性和重复性检测.[结果]SDS-PAGE结果显示,在IPTG终浓度为0.75 mmol/L时,37 ℃诱导8 h的条件下重组BEFV G蛋白表达量最大,且以包涵体形式表达,分子质量约为46 ku.Western blotting结果显示,浓缩纯化后的重组BEFV G蛋白具有较好的反应原性,可作为包被抗原用于免疫胶体金试纸条的建立.在质控线包被的抗体羊抗鼠IgG浓度为2 mg/mL,BEFV G蛋白包被浓度为0.6 mg/mL,喷金量为2.5 μL/cm的条件下,3~5 min就可完成检测.制备的试纸条有较高的敏感性和特异性,血清稀释倍数为40倍的时候显色接近消线,且试纸条仅与BEFV阳性血清发生显色反应,与牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)等其他病毒阳性血清均无交叉反应,阳性血清样本重复性试验证明试纸条的重复性较高,成功建立了免疫胶体金检测方法.[结论]本研究以原核表达的G蛋白为抗原成功制备了检测BEFV的新型免疫胶体金试纸条,该检测试纸条特异性强、稳定性好,适合用于临床快速检测BEF.