Sall4表达调控及其启动子核心调控区的筛选

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作   者：

王亚娴;  杨藩;  王华岩; 

作者机构：

西北农林科技大学动物医学院; 

关键词：

启动子;  转录调控;  Sall4;  猪;  多能性; 

期刊名称：

中国农业科学

基金项目：

猪母源关键多能因子的鉴定及其在体细胞重编程中的作用
转录因子Otx2调控猪干细胞多能状态和启动胚层分化的分子机制

i s s n：

0578-1752

年卷期：

2016 年 49 卷 01 期

页   码：

176-185

摘   要：

【目的】Sall4是一种锌指结构转录因子,对建立和维持动物多能干细胞具有重要意义。为探索猪Sall4的表达和转录调控机制,克隆了猪Sall4启动子,对其进行了功能验证和核心调控区的筛选。【方法】从猪基因组中克隆获得2.1 kb Sall4启动子片段,并构建相应的报告载体;将报告载体p E2.1转染不同种类的细胞,进行细胞特异性表达检测;采用实时荧光定量PCR方法,检测Sall4在猪不同组织和细胞中的表达变化;通过生物信息学方法,分析Sall4启动子上各种关键顺式作用元件和潜在的转录结合位点;将多能转录因子Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b和Smad与Sall4启动子共转染293T细胞,利用双萤光素酶报告系统检测Sall4启动子活性;采用DNA片段缺失的方法,构建一系列Sall4启动子片段缺失报告载体,将缺失片段载体分别转入293T细胞中,并利用双萤光素酶报告系统检测启动子的活性。【结果】Sall4在多能干细胞、生殖细胞和癌化肿瘤细胞中:包括P19、293T、CHO和Hela等细胞中特异性高表达。另外,通过实时荧光定量PCR检测结果显示,Sall4的表达具有明显的组织特异性,其在猪i PS细胞和生殖相关组织,如睾丸和卵巢组织中表达最高,而在脑、心、肝和肌肉等组织中的表达较低,表明该基因与细胞多能性维持具有互作关系。应用JASPAR和GPMiner软件分析发现,Sall4启动子上有TATA box、GC box、CAAT box等顺式作用元件,以及Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b、Stat3和Smad等多能转录因子的预测结合位点。其中,Oct4、Sox2和TGF-beta信号通路因子对Sall4启动子活性有较显著的激活作用,与对照组比较Sall4启动子活性提高了3倍;而Klf4因子对Sall4启动子活性有一定的抑制作用。采用分段PCR的方法,对2.1 kb启动子进行了片段缺失,分别构建了p L2.1、p L1.0和p L0.5等3个报告载体,检测结果发现,在p L2.1与p L1.0之间相差1 kb左右,但是启动子的活性没有显著差异。载体p L1.0与p L0.5之间多了486 bp片段,启动子活性提高了1倍多。另外,p L0.5的启动子活性与对照组比较提高了8倍。这些结果表明,猪Sall4启动子在-367至-852 bp和-1至-366 bp两个区域内存在核心调控区。【结论】克隆了猪Sall4启动子,证明Sall4的表达具有明显的组织特异性;Sall4启动子序列上存在众多潜在的转录因子结合位点和启动子核心调控域,是参与调控Sall4表达的重要序列,这些转录因子与Sall4相互作用对Sall4在多能细胞中的表达调控发挥重要作用。