大肠杆菌头孢菌素C乙酰酯酶的敲除对头孢菌素C酰化酶应用的影响

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作   者：

赵强;  刘洋;  周晶辉;  许岗; 

作者机构：

湖南福来格生物技术有限公司; 

关键词：

3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA);  pTargetF/pCas;  孢菌素C酰化酶(CPCacy);  头孢菌素C乙酰酯酶; 

期刊名称：

中国生物工程杂志

i s s n：

1671-8135

年卷期：

2022 年 42 卷 001 期

页   码：

96-103

摘   要：

7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是合成头孢菌素类抗生素的重要中间体,工业上通常采用头孢菌素C酰化酶一步水解头孢菌素C制备,但在该反应产物中存在一个主要杂质3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA),该杂质的产生是由大肠杆菌中内源基因aes编码的头孢菌素C乙酰酯酶水解头孢菌素C或7-ACA引起的.为了防止D-7-ACA的形成,获得高品质7-ACA,减少下游精制成本,采用大肠杆菌双质粒pTargetF/pCas敲除系统,设计相应的gRNA以及同源修复供体DNA,对大肠杆菌BL21(DE3)中的aes进行敲除,从而获得了 Aes缺陷型菌株BL21(DE3)△aes.将携带头孢菌素C酰化酶(CPCacy)表达质粒pET30-CPCacy的重组工程菌BL21(DE3)/pET30-CPCacy和BL21(DE3)△aes/pET30-CPCacy所诱导表达的孢菌素C酰化酶细胞破碎上清液进行7-ACA的生产对比试验,结果表明,敲除菌BL21(DE3)△aes/pET30-CPCacy对头孢菌素C的转化率为98.8%而原始菌为98.5%,同时7-ACA的产率为80.7%而原始菌株为80.2%,杂质D-7-ACA的产率仅为0.1%,为原始菌的25%,这些工作为进一步生产高品质的7-ACA奠定了基础.