基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS探究朱日亨滴丸抑制巨噬细胞泡沫化的谱效关系

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作   者：

翟琼;  梁方圆;  王跃武;  布仁;  董馨;  陆景坤;  薛培凤; 

作者机构：

内蒙古医科大学基础医学院; 

关键词：

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR);  朱日亨滴丸;  RAW264.7细胞;  抗动脉粥样硬化;  超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS);  谱效关系;  巨噬细胞泡沫化; 

期刊名称：

中国实验方剂学杂志

i s s n：

1005-9903

年卷期：

2024 年 30 卷 010 期

页   码：

176-186

摘   要：

目的:通过对朱日亨滴丸(ZRH)的肠吸收液物质组成与抑制巨噬细胞泡沫化进行相关性分析,探究ZRH的药效成分群,为建立其质量标准提供依据.方法:采用大鼠外翻肠囊法制备ZRH的0、5、10、15、20倍临床等效剂量肠吸收液,并使用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的RAW264.7 巨噬细胞泡沫化模型,通过油红O染色及胆固醇含量测定考察不同剂量ZRH肠吸收液对RAW264.7细胞脂质积累的影响,筛选最佳剂量;采用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱法(UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS)对ZRH肠吸收液中的肠吸收组分进行分析鉴定,以峰面积为自变量,药效指标为因变量,采用SIMCA 13.0软件对不同剂量ZRH肠吸收液进行偏最小二法-乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA),筛选变量重要性投影(VIP)值>1.0的化合物作为贡献性成分,并利用Pearson相关性分析确定谱效相关性;使用分子对接验证过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、PPARy、PPARβ、人视黄醇X受体α(RXRA)和核转录因子-κB(NF-κB)与ZRH肠吸收液中活性成分的结合能;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测RAW264.7细胞中PPARγ、A类Ⅰ型清道夫受体(SRA1)和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Westen blot)检测RAW264.7细胞中PPARγ蛋白表达水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测RAW264.7细胞中白细胞介素(IL)-1β和NF-κB水平.结果:油红O染色、胆固醇含量测定结果显示,ZRH肠吸收液均能够降低巨噬细胞泡沫化程度,以15倍和20倍ZRH肠吸收液效果最佳,最终确定以15倍ZRH肠吸液作为研究对象.谱效关联分析显示,ZRH含药肠液中有52个对应峰与药效呈正相关,包括有机酸类、苯丙素类、环烯醚萜类、黄酮类、胆汁酸类、香豆素类和色酮类.分子对接靶标验证结果显示,86.9%~96.2%的成分与关键靶点PPARα、PPARγ、PPARβ、RXRA和NF-κB具有良好的结合活性,对接能量值均<-6.0 kcal·mol-1(1 cal≈4.19 J);验证结果显示,与正常组比较,模型组SRA1、PPARγ mRNA表达水平显著上升,ABCA1 mRNA表达水平显著下降,PPARγ蛋白表达水平显著上升,IL-1β、NF-κB水平显著上升(P<0.01);与模型组比较,15倍肠吸收液组SRA1、PPARγ mRNA表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01),ABCA1 mRNA表达水平显著上调,IL-1β、NF-κB水平显著降低(P<0.01),PPARγγ蛋白表达水平明显降低(P<0.05).结论:该研究确定了 ZRH肠吸收液中52个与抑制巨噬细胞泡沫化呈正相关的药物成分及其代谢产物,可能与调节细胞中PPARs通路并降低炎症因子水平有关,为ZRH的质量控制和临床应用提供借鉴.