人白细胞介素-26慢病毒表达质粒与基因敲除质粒的构建及其在HEK293T细胞中的活性验证

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作   者：

周海金;  吴珊;  刘丽媛;  蒋丹;  许涛;  蓝华滔;  舒纬童;  徐广贤; 

作者机构：

广东医科大学医学技术学院医学检验系;  宁夏医科大学临床医学院; 

关键词：

生物信息学;  过表达质粒;  基因敲除质粒;  白细胞介素-26; 

期刊名称：

中国生物制品学杂志

i s s n：

1004-5503

年卷期：

2024 年 37 卷 002 期

页   码：

151-159

摘   要：

目的 构建人白细胞介素(interleukin,IL)-26慢病毒表达质粒与基因敲除质粒,为研究IL-26基因在细胞信号通路及细胞自噬中的功能奠定基础.方法 利用RT-PCR从人外周血单个核细胞中扩增IL-26基因序列,克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP真核表达载体中,构建过表达质粒;并根据IL-26外显子序列设计4个敲除靶点Exon1sgRNA1、Exon1sgRNA2、Exon3sgRNA1、Exon3sgRNA2,利用 CRISPR/Cas9 技术构建至 lentiCRISPRv2 载体中,构建基因敲除质粒.将过表达质粒和基因敲除质粒分别瞬时转染至HEK293T细胞,利用RT-qPCR和Western blot验证IL-26 mRNA和蛋白的表达情况.并对IL-26进行氨基酸序列分析、结构预测及亚细胞定位观察.结果 通过酶切、测序鉴定及生物信息学分析显示,IL-26全长516 bp,编码171个氨基酸.IL-26过表达质粒转染的HEK293T细胞与正常对照组相比,IL-26mRNA水平升高了 656.789倍,蛋白质水平升高了 1.978倍,差异均有统计学意义(t分别为 17.976和 7.859,P分别<0.000 1 和<0.001).4个敲除靶点 Exon1sgRNA1、Exon1sgRNA2、Exon3sgRNA1、Exon3sgRNA2质粒转染至HEK293T细胞中后,IL-26的表达水平分别下降了 0.930、0.980、0.523 3和0.316 9倍,其中Exon3-sgRNA2质粒能够显著下调IL-26的表达(t=7.440,P<0.001).IL-26蛋白的前22个氨基酸存在信号肽结构,且具有一定的跨膜功能,IL-26存在于细胞质中.结论 成功构建了IL-26过表达和基因敲除质粒,为后续IL-26功能的研究奠定了基础.