CRISPR/Cas9技术构建的ITGA2B c.2659C>T(p.Q887X)无义突变的血小板无力症小鼠模型对血小板功能的影响

• 全文链接
• 请求原文

作   者：

杨飞;  江淼;  林赠华;  谢展利;  马珍妮;  杨力;  刘红;  王兆钺;  周鹭; 

作者机构：

卫生部血栓与止血重点实验室江苏省血液研究所苏州大学第一附属医院;  南通大学附属医院;  临床医学研究中心苏州科技城医院;  南通大学附属医院血液内科; 

关键词：

小鼠模型;  CRISPR/Cas9;  血小板无力症; 

期刊名称：

中国实验血液学杂志

i s s n：

1009-2137

年卷期：

2022 年 002 期

页   码：

559-564

摘   要：

目的：用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达的ITGA2B c.2659C>T （p.Q887X）无义突变的血小板无力症小鼠模型，并对其血小板膜表面糖蛋白αIIbβ3的功能做进一步研究。方法：根据ITGA2B基因信息设计并合成针对c.2659C位置的供体寡核苷酸和g RNA载体并进行体外转录。将g RNA和Cas9 m RNA与供体寡核苷酸共注射到受精卵，并送回到代孕鼠输卵管中。鼠出生后进行PCR基因分型和序列分析，获得阳性F0鼠。阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，获得经PCR和测序验证的F1代杂合型点突变GT小鼠，而后F1代小鼠通过彼此交配得到纯合型点突变GT小鼠以及对照组WT小鼠。通过检测小鼠鼠尾出血时间和隐静脉出血时间、血小板聚集功能、血小板表面αIIbβ3的表达和功能，对该小鼠模型的表型进一步验证。结果：小鼠鼠尾出血实验表明，GT小鼠割尾后的出血时间较WT小鼠明显延长（P<0.01）。小鼠隐静脉出血实验与鼠尾出血实验结果一致，即割断隐静脉后，GT小鼠的出血时间较WT小鼠明显延长（P<0.01）。在胶原、凝血酶、二磷酸腺苷诱导的血小板聚集实验中，GT小鼠血小板聚集率较WT小鼠有明显降低（P<0.01,P<0.01,P<0.05），表明GT小鼠血小板聚集功能受到明显抑制。流式结果显示，GT小鼠血小板表面αIIbβ3的表达量较WT小鼠明显下降（P<0.01），在凝血酶刺激后，诱导活化的血小板与纤维蛋白原的结合量较WT小鼠明显减少（P<0.01）。纤维蛋白原铺展实验结果显示，GT小鼠的血小板在纤维蛋白原上的铺展面积较WT小鼠显著缩小（P<0.05）。结论：应用CRISPR/Cas9技术成功建立了ITGA2B c.2659C>T （p.Q887X）无义突变的GT小鼠模型。该小鼠模型血小板聚集功能缺陷，符合血小板无力症的表现。