禽流感病毒重组核蛋白抗原的研制及应用

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获奖名称：

科学技术进步奖

获奖区域：

黑龙江省

获奖等级：

一等奖

主要完成人：

于康震; 王秀荣; 邓国华; 杨林; 陈化兰; 田国滨; 姜永萍; 乔传玲; 孙建

关键词：

重组;  蛋;  流感;  禽流感病毒;  流;  核蛋白;  流感病毒;  蛋白;  禽流感;  研制;  重组核蛋白;  抗原;  病毒; 

第一完成单位：

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

获奖时间：

2004

项目名称：

联系人：

杨林

联系电话：

0451-85935199;13613677499

电子邮件：

yanglinx@163.net

邮编：

地址：

黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号

合作完成单位：

单位电话：

0451-85935049

传真：

0451-82733132

网址：

推荐单位(专家)：

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

摘要：

　　课题来源：本课题来源于国家“九五”重点科技攻关项目“动植物重大病虫害防治技术研究”的子专题“禽流感疫病诊断和病毒分型技术的研究”，合同编号为96-005-02-01-02；和国家重点科技攻关项目“农业生物关键技术研究”的专题“禽流感单抗及分子诊断试剂”，合同编号为96-C01-04-04。 　　技术原理和性能指标： 　　技术原理是利用现代分子生物学技术克隆禽流感病毒的特异性保守抗原基因核蛋白基因，再重组到杆状病毒中，实现在杆状病毒中的高效表达，然后收集重组病毒感染的细胞，经过一系列处理获得重组核蛋白成分。以该重组蛋白为抗原，以固相的琼脂凝胶为支持物，利用抗原抗体反应原理，在凝胶中形成大的分子复合物，而出现明显的沉淀线，从而对血清抗体进行定性检查，实现对禽流感的早期诊断。本研究克隆了禽流感病毒的型特异性保守基因核蛋白基因，利用一系列分子生物学技术手段将核蛋白基因和线性的杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞，获得含核蛋白基因的重组杆状病毒；用该重组杆状病毒作为种毒，测定其在Sf9昆虫细胞中的最佳表达参数。再利用适当剂量的重组杆状病毒感染昆虫细胞，实现了重组核蛋白基因在杆状病毒中的高效表达。重组病毒感染72小时后收获感染细胞，加入适当的细胞裂解剂，反复冻融三次以释放出重组核蛋白。表达的重组核蛋白经标定后组装成琼扩诊断试剂盒并成功的运用。重组核蛋白抗原用琼脂扩散方法检测鸡新城疫等其它15种鸡疫病血清，均没有交叉反应；凡是检出阳性的血清均能中和禽流感病毒。重组核蛋白琼扩抗原室温保存9个月以上(冻干后保存)，性能稳定，其特异性与敏感性不变。 　　技术的创造性与先进性： 　　在国内首次克隆了禽流感核蛋白基因并表达出具有全部生物学活性的重组核蛋白，达到国内外同类产品先进水平。世界上绝大多数国家使用的禽流感琼扩抗原不仅生产时间长，工艺复杂，生产成本高，耗费大量的人力物力，产量低，而且得到的抗原效价不稳定，感官形状不佳，难以满足我国现在养禽业的疫病监测的需要。我们首次将重组核蛋白应用于禽流感的琼扩诊断，大大降低了禽流感琼扩抗原的生产成本，简化了禽流感琼扩抗原的生产工艺，缩短了生产周期，提高了抗原的产量和纯度。我们生产的重组琼扩抗原中除了核蛋白这一全病毒琼扩抗原主要的成分外，其余都不是流感病毒成分，具有绝对的生物安全性，没有潜在的散毒危险，这一点是其它禽流感琼扩抗原无法比拟的优越性。必将对我国禽流感的疫病监测及流行病学调查的普及起到极大的推动作用。 　　推广应用的范围和前景：可应用全国各省、市畜牧兽医站、卫生防疫站、口岸检疫部门、研究所、农业院校及基层鸡场等部门的禽流感疫病监测。目前已运用到黑龙江、山东、河南等省的各级相关单位与部门，效果良好，抗原的使用给养禽业带来的经济效益，以及为促进社会物质文明而带来的社会效益都将十分巨大。